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LwaCas13a蛋白的表达纯化与活性分析
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作者 豆玲 李泽轩 +5 位作者 贾訸潇 张彩云 左富江 李婷 谢元江 段晓雷 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2941-2950,共10页
【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15... 【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15b-SUMO-LwaCas13a重组质粒,并进行原核诱导表达与条件优化;发酵100 mL大肠杆菌BL21(DE3)菌诱导表达LwaCas13a蛋白后进行纯化,纯化后利用超滤法浓缩蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。将LwaCas13a蛋白、CRISPR RNA(CrRNA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)靶标RNA及荧光标记单链RNA(ssRNA)探针共孵育,利用全波长荧光分析仪检测CRISPR-LwaCas13a反式切割活性,与商业化Cas13a蛋白进行活性对比,并优化LwaCas13a与CrRNA最佳结合比例。【结果】成功构建重组质粒pET15b-SUMO-LwaCas13a;LwaCas13a重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、18℃诱导16 h;经过纯化最终获得95%纯度、7.5 mg/mL浓度的LwaCas13a蛋白。荧光检测结果显示,LwaCas13a蛋白具有明显的反式切割活性,为商业化Cas13a蛋白活性的1.25倍,且LwaCas13a蛋白与CrRNA的最佳结合比例为1∶2。【结论】试验成功表达纯化出高纯度、高浓度的LwaCas13a重组蛋白,其反式切割活性优于商业化Cas13a蛋白,并明确了该蛋白与CrRNA的最佳配比,为利用LwaCas13a进行动物病毒RNA检测新技术的研发提供了依据。 展开更多
关键词 LwaCas13a蛋白 原核表达 SUMO酶切 反式切割活性
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论前馈控制在企业调度管理中的运用
2
作者 谢元江 《江西铜业工程》 CAS 1995年第4期61-63,共3页
前馈控制实质上是一种超前的管理思想和方法。文章介绍了前馈控制的原理、方法和特点,并结合实际论述了前馈控制在企业调度管理中的具体运用。
关键词 控制 前馈控制 调度管理
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