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小鼠抗寨卡病毒包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体的制备
1
作者 薛潘 董阳超 +7 位作者 武福星 陈洋 张剑 元航 武苏闪 袁若栋 李宝莉 雷迎峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期447-454,共8页
目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表... 目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表达,经过变性、复性和超滤获得纯化的蛋白。将Eecto蛋白3次免疫后,获得多克隆抗体血清,进行效价测定,并利用ZIKV prME真核表达质粒转染的HEK293T细胞进行Western blot法和免疫荧光法分析。取效价较高的小鼠脾脏制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法获取分泌抗体的杂交瘤细胞,并进一步制备腹水。对腹水进行抗体效价测定、亚类分析。以ZIKV同属病毒日本脑炎病毒(JEV)、黄热病病毒(YFV)、登革病毒1-4(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)的Eecto为包被抗原,利用ELISA分析ZIKV单克隆抗体的交叉反应性,进一步对效价高、特异性强的抗体进行特异性分析。结果成功构建了原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,并获得纯化的Eecto蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性;制备筛选得到1D6、4F11、4H7、4F8四株单克隆抗体,其中三株(1D6、4H7、4F8)为IgGκ型抗体,一株(4F11)为IgMκ,1D6腹水效价大于1∶108;其中1D6和4H7为ZIKV特异性抗体,与其他黄病毒无交叉反应。结论成功制备了小鼠抗ZIKV Eecto单克隆抗体,为后续建立ZIKV检测方法及致病机制研究提供了实验材料。 展开更多
关键词 寨卡病毒(ZIKV) 包膜蛋白胞外区(Eecto) 原核表达 单克隆抗体
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小鼠抗西方马脑炎病毒E2蛋白胞外区(E2ecto)单克隆抗体的制备
2
作者 武福星 董阳超 +6 位作者 张剑 薛潘 袁若栋 陈洋 元航 李宝莉 雷迎峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期62-68,共7页
目的制备针对西方马脑炎病毒(WEEV)E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto)的小鼠特异性单克隆抗体(mAb)。方法构建表达WEEV E2ecto的原核表达质粒pET-28a-WEEV E2ecto,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,主要为包涵体形式。包涵体纯化后,通... 目的制备针对西方马脑炎病毒(WEEV)E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto)的小鼠特异性单克隆抗体(mAb)。方法构建表达WEEV E2ecto的原核表达质粒pET-28a-WEEV E2ecto,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,主要为包涵体形式。包涵体纯化后,通过变性、复性、超滤等制备得到E2ecto蛋白;以QuickAntibody-Mouse5W为佐剂,将E2ecto蛋白肌肉免疫BALB/c小鼠,间隔21 d加强1次。免疫后35 d,取效价超过1×104的小鼠腹腔接种1次E2ecto蛋白,3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过有限稀释法筛选稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,接种小鼠腹腔后制备腹水;利用ELISA检测抗体亚型及腹水中抗体效价的水平;将真核表达质粒pCAGGS-WEEV-CE3E2E1转染BHK-21细胞,通过免疫荧光法(IFA)鉴定上述mAb的生物学活性;利用东方马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的E2ecto蛋白进行ELISA鉴定上述抗体的特异性。结果成功表达及复性获得了纯化的WEEV E2ecto蛋白;制备了3G6G10、3D7G2、3B9E8、3D5B7四株mAb,其亚型分别为IgG2c(κ)、IgM(κ)、IgM(κ)、IgG1(κ);3G6G10、3B9E8、3D7G2腹水抗体效价均为105,3D5B7达到107;该4株抗体与VEEV和EEEV等其他脑炎甲病毒无交叉反应。结论成功制备了4株特异性结合WEEVE2ecto的小鼠mAb。 展开更多
关键词 西方马脑炎病毒(WEEV) E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto) 原核表达 单克隆抗体(mAb)
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森林脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的表达、纯化及免疫原性分析 被引量：1
3
作者 陈洋 张剑 +8 位作者 陈华 薛潘 武福星 袁明城 袁若栋 董阳超 叶伟 叶传涛 雷迎峰 《空军军医大学学报》 CAS 2023年第6期536-540,共5页
目的构建森林脑炎病毒(TBEV)森张株包膜糖蛋白E胞外区的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达、纯化及初步分析其免疫原性。方法从GenBank下载TBEV森张株E蛋白胞外区基因序列(Eecto),密码子优化后交由公司合成,通过双酶切的方法克隆至... 目的构建森林脑炎病毒(TBEV)森张株包膜糖蛋白E胞外区的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达、纯化及初步分析其免疫原性。方法从GenBank下载TBEV森张株E蛋白胞外区基因序列(Eecto),密码子优化后交由公司合成,通过双酶切的方法克隆至pET28a载体,获得重组质粒pET28a-TBEV-Eecto。经过酶切和测序分析后,将正确的重组质粒转化BL21(DE3)感受态,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫化半乳糖苷诱导表达后通过SDS-PAGE分析重组E蛋白胞外区的表达形式。纯化的包涵体用6 mol/L盐酸胍进行变性溶解,用含有非表面活性剂NDSB-201的缓冲液进行复性,之后超滤浓缩、镍柱亲和层析纯化及蛋白印迹鉴定。将获得的纯化TBEV-Eecto蛋白免疫BALB/c小鼠,利用免疫血清进行蛋白印迹、免疫荧光实验分析其特异性。结果重组质粒pET28a-TBEV-Eecto经酶切后的片段与预期大小一致,测序分析正确。重组蛋白TBEV-Eecto主要以包涵体形式表达,经过盐酸胍变性溶解、NDSB-201复性、超滤及镍柱亲和纯化后获得纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析均显示其与预期大小一致。纯化的TBEV-Eecto蛋白免疫小鼠血清可特异性识别真核表达的TBEV-PrME蛋白,提示TBEV-Eecto具有良好的免疫原性。结论成功构建TBEV森张株E蛋白胞外区的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达。纯化的TBEV-Eecto蛋白具有较好的免疫原性,为森林脑炎的血清学诊断方法和亚单位疫苗研制提供了基础。 展开更多
关键词 森林脑炎病毒 包膜蛋白 胞外区 原核表达 免疫原性
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仙台病毒递送新型冠状病毒RBD蛋白鼻内免疫接种增强呼吸道黏膜和系统性免疫应答的初步研究
4
作者 袁明城 张剑 +7 位作者 陈洋 薛潘 武福星 袁若栋 董阳超 徐志凯 张芳琳 雷迎峰 《空军军医大学学报》 CAS 2023年第7期609-614,共6页
目的 研究仙台病毒(SeV)作为递送载体在增强新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD蛋白诱导呼吸道黏膜和系统性免疫应答的特征。方法 利用同源重组技术构建SARS-CoV-2 RBD与抗体Fc融合蛋白编码基因的真核表达质粒,将其转染293-T细胞中进行表达并... 目的 研究仙台病毒(SeV)作为递送载体在增强新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD蛋白诱导呼吸道黏膜和系统性免疫应答的特征。方法 利用同源重组技术构建SARS-CoV-2 RBD与抗体Fc融合蛋白编码基因的真核表达质粒,将其转染293-T细胞中进行表达并用Western blotting验证;将RBD-Fc融合蛋白表达质粒转染293-T细胞大量表达并使用亲和层析进行蛋白纯化;通过SeV递送RBD-Fc蛋白进行鼻内免疫接种,同时设置RBD-Fc组、SeV组、PBS组作为对照,各组分别在2周后加强免疫1次,3周后检测血清样本和肺泡灌洗液(BALF)中特异性抗体水平。结果 RBD、Fc蛋白编码基因片段通过重叠PCR方法得到融合蛋白基因片段(RBD-Fc),成功构建pCAGGS-RBD-Fc真核表达质粒;Western blotting结果显示RBD-Fc融合蛋白的表达条带符合预期大小,大量表达后经亲和层析获得一条单一的接近Mr 60 000的条带,与预期大小一致,纯度高;与RBD-Fc组、SeV组、PBS组相比,SeV递送RBD-Fc蛋白通过鼻腔加强免疫小鼠后的血清样本和BALF中均可检测到RBD特异性IgG(血清样本:P<0.01;BALF样本:P<0.05),且BALF中RBD特异性IgA相比RBD-Fc组有一定升高。结论 SeV在递送SARS-CoV-2 RBD蛋白进行鼻内免疫接种方面能够诱导一定水平的黏膜免疫和系统性免疫,为呼吸道传染病的黏膜疫苗研究奠定了初步的实验基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 RBD-Fc蛋白 黏膜免疫 仙台病毒
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RPA-毛细管电泳检测人腺病毒55型的方法建立及初步应用
5
作者 袁若栋 董阳超 +9 位作者 武福星 段甜 薛潘 张剑 袁明城 薛智丰 张海军 张欠欠 雷迎峰 高小朋 《空军军医大学学报》 CAS 2024年第1期66-72,共7页
目的建立重组酶聚合酶扩增(RPA)技术联合毛细管电泳快速检测人腺病毒55型(HAdV55)的方法及初步应用。方法构建HAdV55-Hexon质粒作为扩增模板,针对HAdV55保守区Hexon基因序列设计RPA特异性引物,对引物筛选和优化,并建立RPA扩增及联合毛... 目的建立重组酶聚合酶扩增(RPA)技术联合毛细管电泳快速检测人腺病毒55型(HAdV55)的方法及初步应用。方法构建HAdV55-Hexon质粒作为扩增模板,针对HAdV55保守区Hexon基因序列设计RPA特异性引物,对引物筛选和优化,并建立RPA扩增及联合毛细管电泳检测体系,进行了特异性、灵敏度、可靠性评价;对18份临床样本进行RPA毛细管电泳检测。结果构建了含有HAdV55-Hexon全长基因的质粒,获得一对扩增效率最高的RPA引物;HAdV55的RPA毛细管电泳检测体系最低检出限为2.9×10^(3) copies/mL,整个过程30 min即可完成,冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1)、甲型乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒标准品提取物用该体系检测时均为阴性,且检测常见的人腺病毒类型(HAdV3、HAdV4、HAdV7、HAdV16、HAdV21)时也均为阴性,可认为对HAdV55有较强的特异性检测;建立的RPA毛细管电泳检测能够有效地检测出临床患者咽拭子中的HAdV55。结论RPA联合毛细管电泳检测HAdV55方法的建立为其临床诊断提供了良好的基础。 展开更多
关键词 人腺病毒55型 重组酶聚合酶扩增 毛细管电泳
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小鼠抗人腺病毒55型六邻体(HAdV55 Hexon)蛋白单克隆抗体的制备 被引量：2
6
作者 袁若栋 董阳超 +9 位作者 武福星 段甜 薛潘 张剑 袁明城 薛智丰 张海军 张欠欠 高小朋 雷迎峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期544-551,共8页
目的制备特异性小鼠抗人腺病毒55型六邻体蛋白(HAdV55 Hexon)单克隆抗体(mAb)。方法以化学合成HAdV 55、3、4、7、16、21的Hexon基因为模板,PCR扩增后分别构建原核表达质粒pET28a-HAdV55 Hexon与真核表达质粒pCAGGS-HAdV3、4、7、16、21... 目的制备特异性小鼠抗人腺病毒55型六邻体蛋白(HAdV55 Hexon)单克隆抗体(mAb)。方法以化学合成HAdV 55、3、4、7、16、21的Hexon基因为模板,PCR扩增后分别构建原核表达质粒pET28a-HAdV55 Hexon与真核表达质粒pCAGGS-HAdV3、4、7、16、21、55 Hexon;将pET28a-HAdV55 Hexon质粒转化至大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化的包涵体经过变性与复性后利用切向流膜过滤系统获得纯化蛋白;将pCAGGS-HAdV55 Hexon用于拔罐免疫BALB/c小鼠,HAdV55 Hexon蛋白用于加强免疫,通过杂交瘤技术制备抗HAdV55 Hexon的mAb,并进行抗体效价测定、抗体亚类鉴定;对上述抗体利用pCAGGS-HAdV55 Hexon转染HEK293T细胞和BHK细胞分别进行Western blot法和免疫荧光法(IFA)以鉴定其特异性;选择其中效价高的两株抗体,进一步利用pCAGGS-HAdV3、4、7、16、21、55 Hexon转染细胞分别进行Western blot法和IFA做交叉反应性分析。结果成功构建pET28a-HAdV55 Hexon和pCAGGS-HAdV55 Hexon、3、4、7、16、21表达质粒;IPTG诱导pET28a-HAdV55 Hexon转化的BL21细菌,HAdV55 Hexon蛋白主要以包涵体形式表达,经过变性及复性后超滤得到纯化的HAdV55 Hexon蛋白;筛选得到6株可分泌HAdV55 Hexon mAb的杂交瘤细胞株,抗体亚类分析显示2株为IgG2a亚型,4株为IgG2b;获得与HAdV3 Hexon、HAdV4 Hexon、HAdV7 Hexon、HAdV16 Hexon、HAdV21 Hexon无交叉反应性的2株高效价的特异性HAdV55 Hexon抗体。结论获得的特异性小鼠抗HAdV55 Hexon的mAb为建立其抗原检测方法提供了实验基础。 展开更多
关键词 人腺病毒55型(HAdV55) 六邻体蛋白(Hexon) 单克隆抗体(mAb)
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纳米孔测序技术检测正常人群咽拭子微生物本底的初步分析 被引量：1
7
作者 薛智丰 王超 +4 位作者 董阳超 段甜 袁若栋 雷迎峰 岳昌武 《微生物学免疫学进展》 CAS 2022年第3期50-56,共7页
目的分析咽拭子中存在多种少量的机会致病性微生物(即病原体本底),为测序数据提供初步分析结果。方法利用牛津纳米孔测序技术(oxford nanopore technologies)对12个健康人的咽拭子样本进行测序并分析微生物序列。结果咽拭子样本中主要... 目的分析咽拭子中存在多种少量的机会致病性微生物(即病原体本底),为测序数据提供初步分析结果。方法利用牛津纳米孔测序技术(oxford nanopore technologies)对12个健康人的咽拭子样本进行测序并分析微生物序列。结果咽拭子样本中主要是常见的宿主共生菌群,具体为拟杆菌门(29.000%~55.000%)、变形菌门(12.000%~24.000%)、厚壁菌门(4.000%~7.000%)、梭杆菌门(2.000%~3.000%)和放线菌门(0.300%-1.000%)等。在拟杆菌门中,普雷沃菌(82.000%~93.000%)、黄杆菌(2.000%~9.000%);变形菌门中,γ-变形菌(61.000%~79.000%)、β-变形菌(5.000%~28.000%);厚壁菌门中,链球菌(35.000%~61.000%)、葡萄球菌(2.000%~7.000%)、韦荣球菌(17.000%~33.000%)、梭菌(2.000%~5.000%)、微单胞菌(0.6000%~1.000%);梭杆菌门中,梭杆菌(54.000%~84.000%)、纤毛菌(9.000%~25.000%);放线菌门中,放线菌(19.000%~47.000%)。最后,还在样本中检测出了少量的病毒,鉴定结果显示这些病毒主要是寄生在口腔中的细菌噬菌体。结论研究为临床宏基因组测序技术在呼吸道样本中病原体分析奠定了基础。 展开更多
关键词 咽拭子 纳米孔测序 病原体本底数据
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