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基于Methylovorus sp.J1-1基因组尺度代谢网络优化吡咯喹啉醌合成 被引量：4
1
作者 寇航 王艳梅 +4 位作者 李彤 薄明井 张惟材 熊向华 黎明 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期173-183,共11页
通过构建Methylovorus sp.J1-1基因组尺度代谢网络模型(genome scale of metabolic network model,GSMM),发掘能够提升吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)产量的发酵策略和相关靶基因。基于其注释的基因组和生化信息,构建J1-1的G... 通过构建Methylovorus sp.J1-1基因组尺度代谢网络模型(genome scale of metabolic network model,GSMM),发掘能够提升吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)产量的发酵策略和相关靶基因。基于其注释的基因组和生化信息,构建J1-1的GSMM。再通过COBRApy预测可能使PQQ产量提高的氨基酸和潜在的靶基因并进行验证。构建了Methylovorus sp.J1-1的GSMM模型iKH584,共有584个基因,779个生化反应,121个交换反应与765个代谢产物,且可以用于后续模拟。根据iKH584模拟,外源添加谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸、过表达glyA与hps1以及敲除hps2基因,均具有促进PQQ合成效果。结果表明:添加谷氨酸与脯氨酸时,PQQ的产量分别提高了10.4%与22.9%;过表达基因glyA与hps1,PQQ产量分别提高20.6%与14.6%;敲除基因hps2,PQQ产量最高可达140.84 mg/L,提高了8.0%,这与模拟结果基本一致,表明构建的模型基本正确。最后,在5 L发酵罐进行J1-1△hps2的分批补料发酵,PQQ的产量为812.64 mg/L,比亲本菌株提高了11.1%。建立的模型可以用来指导J1-1的发酵和菌株改造,提高PQQ产量。 展开更多
关键词 Methylovorus sp.J1-1 基因组尺度代谢网络模型 吡咯喹啉醌 氨基酸 靶基因预测
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通过突变甲醇脱氢酶启动子提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量 被引量：2
2
作者 孙晓宇 薄明井 +3 位作者 杨亚欣 张惟材 葛欣 熊向华 《生物技术通讯》 CAS 2019年第5期609-613,692,共6页
目的:考察甲基营养菌J1-1甲醇脱氢酶启动子活性与吡咯喹啉醌(PQQ)产量的相关性。方法:通过定点突变甲醇脱氢酶P0771启动子,利用lacZ作为报告基因检测突变启动子的转录水平,筛选出活性下降的突变启动子在J1-1中替换天然启动子获得突变菌... 目的:考察甲基营养菌J1-1甲醇脱氢酶启动子活性与吡咯喹啉醌(PQQ)产量的相关性。方法:通过定点突变甲醇脱氢酶P0771启动子,利用lacZ作为报告基因检测突变启动子的转录水平,筛选出活性下降的突变启动子在J1-1中替换天然启动子获得突变菌株,检测突变菌株甲醇脱氢酶表达、酶活以及菌体生长和PQQ产量。结果:定点突变了7个P0771启动子,利用lacZ作为报告基因筛选出2个启动活性较天然启动子下降的突变启动子P0771-1、P0771-5,替换J1-1中天然启动子获得的突变菌株甲醇脱氢酶酶活都低于J1-1,在增菌培养基中其PQQ的合成水平分别提高约9.76%、11.6%。结论:通过启动子突变,降低甲醇脱氢酶启动子活性可以提高J1-1的PQQ产量。 展开更多
关键词 甲基营养菌 定点突变 甲醇脱氢酶 吡咯喹啉醌
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食甲基菌吡咯喹啉醌生物合成相关基因的筛选及表型鉴定
3
作者 薄明井 寇航 +3 位作者 陈静 张惟材 葛欣 熊向华 《生物技术通讯》 CAS 2020年第6期653-658,共6页
目的:通过Tn5转座诱变筛选食甲基菌中吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成相关基因。方法:通过Tn5转座诱变食甲基菌J1-1,筛选PQQ合成水平变化明显的突变株,利用质粒拯救法鉴定突变位点,进而敲除对应基因验证其与PQQ合成的关系,再检测野生菌及敲除菌... 目的:通过Tn5转座诱变筛选食甲基菌中吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成相关基因。方法:通过Tn5转座诱变食甲基菌J1-1,筛选PQQ合成水平变化明显的突变株,利用质粒拯救法鉴定突变位点,进而敲除对应基因验证其与PQQ合成的关系,再检测野生菌及敲除菌的NADH和NAD+含量。结果:构建了库容量为1.0×105的Tn5转座突变体库,筛选得到1株PQQ合成水平显著下降的突变株5-179,经鉴定Tn5转座子插入染色体第705454位,位于mpq-0708基因内部(705337~705933),该基因编码NADH醌氧化还原酶亚基C;通过同源重组敲除J1-1中mpq-0708基因,敲除菌在高产培养基中PQQ合成水平显著下降,仅为野生菌的3.15%,与5-179突变株表型相符;野生菌及敲除菌NADH与NAD+测定结果表明,NADH/NAD+比值代表的菌体能量代谢状态与PQQ生物合成及菌体生长显著关联。结论:mpq-0708基因可能通过能量代谢参与PQQ生物合成。 展开更多
关键词 Tn5转座 吡咯喹啉醌 NADH/NAD+ 能量代谢 食甲基菌
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