克隆牦牛过渡蛋白2(transition protein 2,TNP2)基因并分析其分子特征,调查TNP2基因和蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸中的表达差异,为研究其在睾丸发育及精子发生中的作用提供依据。采集不同发育阶段牦牛睾丸(初生期、幼年期、性成熟初期...克隆牦牛过渡蛋白2(transition protein 2,TNP2)基因并分析其分子特征,调查TNP2基因和蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸中的表达差异,为研究其在睾丸发育及精子发生中的作用提供依据。采集不同发育阶段牦牛睾丸(初生期、幼年期、性成熟初期、性成熟后期、老年期)组织,在克隆测序的基础上对TNP2基因进行分子特征分析;利用免疫组化(IHC)、荧光定量PCR(RT-qPCR)以及Western blot技术检测TNP2蛋白在牦牛睾丸组织中的定位及TNP2基因和蛋白在牦牛睾丸组织中的表达量。结果显示,成功克隆牦牛TNP2的基因CDS区序列,分子特征预测TNP2为可溶性的膜外蛋白,有多个磷酸化位点;其二级结构包含α螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲,其核苷酸序列及氨基酸序列与其他哺乳动物之间的同源性较低。RT-qPCR结果显示,TNP2 mRNA在老年期睾丸的相对表达量极显著(P<0.01)高于其他4个时期,且在幼年期极显著(P<0.01)高于初生期、性成熟早期和性成熟后期,而初生期与性成熟早期和性成熟后期三者之间无显著差异(P>0.05)。Western blot结果显示TNP2蛋白在性成熟早期和性成熟后期的表达量极显著(P<0.01)高于初生期、幼年期和老年期,且幼年期和老年期极显著高于初生期(P<0.01)。IHC结果显示,TNP2蛋白在牦牛睾丸中圆形精细胞以及精子中呈强阳性表达,而在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、支持细胞及睾丸间质细胞呈弱阳性表达。研究表明,TNP2可能参与了牦牛精子发育过程中圆形精子细胞向长形精子细胞转换过程中细胞核蛋白的转换,为进一步探明牦牛精子形成机制及其长期生活在高寒低氧环境中的耐低氧机制与繁殖能力低之间的关系提供了基础资料。展开更多
