鸡γ-干扰素实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：9

1

作者 王群 刘光亮 +2 位作者 童铁钢 肖一红 吴东来 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期631-635,共5页

为建立一种检测鸡γ干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ干扰素（ChIFN-γ）和鸡的28 S rRNA（Ch28 S）基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch2... 为建立一种检测鸡γ干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ干扰素（ChIFN-γ）和鸡的28 S rRNA（Ch28 S）基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28 S的RNA,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28 S RNA作为内参进行一步法实时荧光定量RT-PCR,检测ChIFN-γ.结果表明：ChIFN-γ和内参Ch28 S的Ct值与标准品稀释梯度在1×102～1×107拷贝/μL范围分别呈良好的线性关系,γ2均大于0.99.此方法用于检测ChIFN-γ,具有简便、高效、敏感、特异的特点. 展开更多

关键词 鸡-γ干扰素 实时荧光定量RT-PCR 检测方法

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5种人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的初步建立 被引量：9

2

作者 孙庆歌 杨银辉 +8 位作者 张维军 王群 康晓平 李永强 白宇 童铁钢 杨涛 步志高 吴东来 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期785-789,共5页

为建立可同时检测裂谷热病毒(RVFV)、戊型肝炎病毒(HEV)、狂犬病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)及口蹄疫病毒(FMDV)5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的上述5种病毒的全基因组序列,设计了5对多重PCR引物,... 为建立可同时检测裂谷热病毒(RVFV)、戊型肝炎病毒(HEV)、狂犬病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)及口蹄疫病毒(FMDV)5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的上述5种病毒的全基因组序列,设计了5对多重PCR引物,通过优化反应条件,建立检测以上5种病毒的多重RT-PCR方法。通过对同一种属的其他病毒及相关病毒的检测,确定方法的特异性;通过对体外转录合成的RNA进行定量检测的方法,确定方法的敏感度。实验结果表明:在同一RT-PCR反应体系中可同时检测以上5种病毒,扩增片段长度分别为499bp、137bp、274bp、224bp、389bp;而对新城疫病毒(NDV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛流行热病毒(BEFV)和乙型脑炎病毒(JBEV)的检测均为阴性;5种病毒RNA的最低检测拷贝数分别为2.91×104、3.14×103、1.25×103、6.65×103和2.38×104。利用该方法对11份RV已知阳性样本和7份HEV已知阳性样本检测结果均呈阳性。本研究建立了一种快速、可同时检测5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR检测方法,该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。 展开更多

关键词 裂谷热病毒 戊型肝炎病毒 狂犬病毒 水泡性口炎病毒 口蹄疫病毒 多重RT-PCR

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马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏菌中表达及其多克隆抗体制备 被引量：7

3

作者 白宇 童铁钢 +5 位作者 刘光亮 肖一红 王群 徐树兰 张维军 吴东来 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期878-882,共5页

采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMC)中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素(Equine interferon-γ,EIFN-γ)基因,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒(pCR-EIFN-γ)中扩增马干扰素成熟蛋白(Mature EIFN-γ,reEIFN... 采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMC)中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素(Equine interferon-γ,EIFN-γ)基因,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒(pCR-EIFN-γ)中扩增马干扰素成熟蛋白(Mature EIFN-γ,reEIFN-γ)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明,mEIFN-γ基因全长为441bD,含一个开放阅读框,编码146个氨基酸的成熟蛋白;对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,重组蛋白相对分子量约为18Ku,且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下,采用Ni^+亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体,为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。 展开更多

关键词 马γ-干扰素 表达 纯化 多克隆抗体

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检测马白细胞介素-18双抗体夹心ELISA方法的建立 被引量：4

4

作者 童铁钢 白宇 +4 位作者 张维军 王群 刘光亮 徐树兰 吴东来 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期364-365,368,共3页

目的:建立检测马白细胞介素-18(equine interleu-kin-18,EIL-18)的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的EIL-18的2株单克隆抗体(mAb)B1G1和S6A3纯化后,利用生物素标记试剂盒对B1G1株mAb进行标记,... 目的:建立检测马白细胞介素-18(equine interleu-kin-18,EIL-18)的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的EIL-18的2株单克隆抗体(mAb)B1G1和S6A3纯化后,利用生物素标记试剂盒对B1G1株mAb进行标记,以重组马白细胞介素-18(rEIL-18)为捕获抗原进行ELISA检测来建立EIL-18双抗体夹心ELISA。结果:经过方阵滴定试验确定捕获抗体的最佳浓度为4mg/L,检测抗体的工作效价为1∶2000。建立的方法可检测马血清中的EIL-18,与猪、牛和羊血清中的IL-18不发生交叉性反应,此方法检测敏感度达到15ng/L,特异性良好。结论:成功建立了EIL-18的双抗体夹心ELISA,为马细胞免疫学研究提供了方法,也为下一步EIL-18ELISA试剂盒的商品化开发奠定了坚实基础。 展开更多

关键词 马白细胞介素-18 单克隆抗体 夹心ELISA

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马白细胞介素18成熟蛋白(mEIL-18)基因在大肠埃希氏菌中的高效表达与纯化 被引量：3

5

作者 童铁钢 刘光亮 +5 位作者 白宇 肖一红 王群 李少英 孟庆文 吴东来 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期307-312,共6页

用RT-PCR从经ConA刺激的马外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出马白细胞介素18(Equine interleu-kin-18,EIL-18)前体蛋白(precursor EIL-18,pEIL-18)基因的cDNA,然后克隆至载体pCR2.1-TOPO中,鉴定并命名为pCR2.1-pEIL-18。自pCR2.1-pEIL-18... 用RT-PCR从经ConA刺激的马外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出马白细胞介素18(Equine interleu-kin-18,EIL-18)前体蛋白(precursor EIL-18,pEIL-18)基因的cDNA,然后克隆至载体pCR2.1-TOPO中,鉴定并命名为pCR2.1-pEIL-18。自pCR2.1-pEIL-18中扩增马白细胞介素18成熟蛋白(mature EIL-18,mEIL-18)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中。将筛选出的阳性克隆进行测序、诱导表达并纯化其表达产物。结果表明,mEIL-18基因全长474 bp,含1个开放阅读框,编码157个氨基酸的成熟蛋白;表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,经SDS-PAGE和Western-blot分析,重组蛋白相对分子量约为20 ku,且具有免疫生物学活性。mEIL-18基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下采用Ni+亲和层析纯化方法获得了高纯度的重组mEIL-18,为探究马白细胞介素18的生物学活性及其应用奠定了基础。 展开更多

关键词 mEIL-18 克隆 表达 纯化

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鸡β_2微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化 被引量：3

6

作者 刘光亮 童铁钢 +1 位作者 孟庆文 吴东来 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期649-652,共4页

β2微球蛋白(β2m)是组成主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子复合体的轻链分子,对于MHCⅠ类分子在细胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少。本试验从来航鸡全血细胞中克隆了鸡β2m(Chβ2m)全基因,利用软件预测了其信号肽序列,并构建... β2微球蛋白(β2m)是组成主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子复合体的轻链分子,对于MHCⅠ类分子在细胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少。本试验从来航鸡全血细胞中克隆了鸡β2m(Chβ2m)全基因,利用软件预测了其信号肽序列,并构建了表达成熟Chβ2m的重组载体,在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式高效表达。将所得包涵体溶于8 mol/L脲,并在变性条件下对包涵体中的重组Chβ2m进行纯化,获得了高纯度的Chβ2m,为制备MHCⅠ四聚体及探索禽类MHCⅠ类分子结构与功能的关系提供了条件。 展开更多

关键词 鸡 Β2微球蛋白 基因克隆 高效表达 纯化

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H5亚型禽流感病毒核蛋白基因重组质粒的构建及其在Hela细胞的瞬时表达 被引量：2

7

作者 刘光亮 王群 +3 位作者 童铁钢 肖一红 孟庆文 吴东来 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期189-192,共4页

采用PCR技术从重组质粒pMel-NP扩增得到了禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang-dong/1/96(H5N1)株的核蛋白(NP)基因,将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX-NP阳性克隆转染Hela细胞,48 h后经间接免疫荧光试验和Western-blotting检测... 采用PCR技术从重组质粒pMel-NP扩增得到了禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang-dong/1/96(H5N1)株的核蛋白(NP)基因,将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX-NP阳性克隆转染Hela细胞,48 h后经间接免疫荧光试验和Western-blotting检测,NP基因在Hela细胞中已成功瞬时表达。表达产物的分子质量约为57 ku,它与H5N1亚型AIV多克隆抗血清有较好的免疫反应。 展开更多

关键词 H5N1亚型禽流感病毒 NP基因 瞬时表达

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猪MHC-Ⅰ α生物素化序列融合基因的构建、表达与纯化 被引量：2

8

作者 肖一红 刘光亮 +4 位作者 王群 童铁钢 白宇 孟庆文 吴东来 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期456-460,共5页

采用RT-PCR技术从猪外周血单核细胞(PBMC)中获得猪白细胞抗原基因座P1、P14等位基因的胞外区,并在其3′端拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP),构建了pET-P1-BSP和pET-P14-BSP高效表达载体并进行诱导表达和纯化,用SDS-PAGE和Western ... 采用RT-PCR技术从猪外周血单核细胞(PBMC)中获得猪白细胞抗原基因座P1、P14等位基因的胞外区,并在其3′端拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP),构建了pET-P1-BSP和pET-P14-BSP高效表达载体并进行诱导表达和纯化,用SDS-PAGE和Western blotting法对表达产物进行鉴定。结果显示,成功构建了融合表达载体pET-P1-BSP和pET-P14-BSP,表达产物以包涵体的形式存在,获得高纯度的P1-BSP和P14-BSP蛋白,为进一步利用亲和素在体外构建SLA-I类分子肽四聚体奠定了基础。 展开更多

关键词 MHC-Ⅰ SLA-Ⅰ 克隆 生物素化序列 表达 纯化

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马γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法的建立 被引量：2

9

作者 白宇 童铁钢 +4 位作者 张维军 徐树兰 王群 刘光亮 吴东来 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期464-466,共3页

目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-... 目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-γ进行ELISA检测来建立马γ-干扰素双抗体夹心ELISA。结果:经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1mg/L,检测抗体的工作效价为1∶1000。利用建立的方法对不同稀释度的重组马γ-干扰素和丝裂原刺激的马外周血单核细胞培养上清进行检测。结论:此方法检测敏感度达到1μg/L,特异性良好,为马的细胞免疫学研究提供了方法,并为建立马γ-干扰素ELISPOT检测方法奠定了基础。 展开更多

关键词 马γ-干扰素 夹心ELISA

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抗马干扰素-γ单克隆抗体的异硫氰酸荧光素标记及应用 被引量：2

10

作者 白宇 张维军 +5 位作者 童铁钢 王群 徐树兰 孙庆歌 杨涛 吴东来 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第2期188-191,共4页

目的用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗马干扰素-γ(IFN-γ)单克隆抗体,为建立马IFN-γ细胞内细胞因子染色方法提供实验材料。方法利用FITC标记纯化的抗马IFN-γ单克隆抗体(SB10),荧光抗体经系列稀释后,对马外周血单核细胞(PBMC)进行细胞内... 目的用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗马干扰素-γ(IFN-γ)单克隆抗体,为建立马IFN-γ细胞内细胞因子染色方法提供实验材料。方法利用FITC标记纯化的抗马IFN-γ单克隆抗体(SB10),荧光抗体经系列稀释后,对马外周血单核细胞(PBMC)进行细胞内细胞因子IFN-γ单染色的流式细胞术检测,同时与商品化FITC标记的抗牛IFN-γ单克隆抗体(CC302)进行流式细胞术检测对比试验。结果FITC-CC302染色马PBMC,1μl荧光抗体染色106个细胞时,分泌IFN-γ的细胞频率为9.35%,而FITC-SB10经系列稀释染色,在用0.25μl荧光抗体染色106个细胞时,分泌IFN-γ的细胞频率为9.90%。结论所制备的FITC标记的抗马IFN-γ单克隆抗体,可为建立马细胞免疫学研究方法奠定物质基础,进而为建立监测马机体免疫状态和研究机体免疫机制提供技术平台。 展开更多

关键词 马干扰素-γ 单克隆抗体 异疏氰酸荧光素 细胞内细胞因子染色

原文传递

马β_2-微球蛋白基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的高效表达与纯化 被引量：1

11

作者 童铁钢 刘光亮 +4 位作者 徐树兰 王群 肖一红 孟庆文 吴东来 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第11期851-855,共5页

为了构建马MHCⅠ四聚体分子,从马外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,采用RT-PCR技术对去除信号肽部分的2βm基因进行了扩增,将其RT-PCR产物经纯化、BamHⅠ+XhoⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pET-28a(+)进行连接,转化入感受态细胞B... 为了构建马MHCⅠ四聚体分子,从马外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,采用RT-PCR技术对去除信号肽部分的2βm基因进行了扩增,将其RT-PCR产物经纯化、BamHⅠ+XhoⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pET-28a(+)进行连接,转化入感受态细胞BL21(DE3)。将筛选出的阳性克隆进行测序、诱导表达并将其表达产物进行纯化。结果表明,去除信号肽部分的马2βm基因全长300 bp,含有1个开放阅读框,编码一由99个氨基酸组成的成熟蛋白;表达产物以包涵体的形式存在,经SDS-PAGE和Western-blotting分析,重组蛋白的分子质量约为15 ku,且具有免疫生物学活性。 展开更多

关键词 马β2-微球蛋白 基因 克隆 表达 纯化

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重组马γ-干扰素抗病毒活性测定及单克隆抗体抑制活性鉴定 被引量：2

12

作者 白宇 陈伟业 +7 位作者 童铁钢 张维军 徐树兰 王群 孙庆歌 刘光亮 步志高 吴东来 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1258-1262,共5页

为了测定大肠杆菌和杆状病毒表达的重组马γ-干扰素是否具有抗病毒活性,利用这两种干扰素处理马胎肾细胞(EFK-78),然后接种表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水泡性口炎病毒(VSV*GFP),观察干扰素对病毒表达GFP的抑制,测出其抗病毒活性单位分... 为了测定大肠杆菌和杆状病毒表达的重组马γ-干扰素是否具有抗病毒活性,利用这两种干扰素处理马胎肾细胞(EFK-78),然后接种表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水泡性口炎病毒(VSV*GFP),观察干扰素对病毒表达GFP的抑制,测出其抗病毒活性单位分别为1×103AU/mL、1×105AU/mL。评价了制备的九株抗重组马γ-干扰素单克隆抗体是否可抑制重组马γ-干扰素抗病毒活性,证实其中一株可中和重组马γ-干扰素的抗病毒活性。结果表明:杆状病毒表达的马γ-干扰素具有较高的抗病毒活性,其活性可被一株制备的抗重组马γ-干扰素单克隆抗体抑制;首次获得原核表达的具有抗病毒活性的马γ-干扰素。 展开更多

关键词 马γ-干扰素 抗病毒活性测定 单克隆抗体

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泛素基因介导下的猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因对小鼠的免疫试验 被引量：1

13

作者 张维军 童铁钢 +7 位作者 白宇 王群 徐树兰 孙庆歌 田野 杨涛 童光志 吴东来 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期799-806,共8页

【目的】获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)M蛋白基因及其与泛素(Ubiquitin,Ub)基因融合的真核表达质粒,并进一步研究Ub对M基因免疫效果的影响。【方法】利用RT-PCR技术以PRRSV C... 【目的】获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)M蛋白基因及其与泛素(Ubiquitin,Ub)基因融合的真核表达质粒,并进一步研究Ub对M基因免疫效果的影响。【方法】利用RT-PCR技术以PRRSV CH-1a株和BALB/c小鼠脾脏组织总RNA为模板,分别扩增出PRRSVM蛋白基因与小鼠的Ub基因,利用SOE技术将PRRSVM基因与小鼠Ub基因进行融合,最终构建真核表达质粒pVAX1-M与pVAX1-U-M。以两种真核表达质粒DNA肌肉免疫BALB/c小鼠后,分别检测体液免疫反应与细胞免疫反应,比较M单基因与Ub-M融合基因DNA免疫所诱生的免疫应答强度【结果】IFA试验表明,pVAX1-M与pVAX1-U-M均能BHK-21细胞内成功表达目的基因;两种重组质粒免疫小鼠后均可诱生PRRSVELISA抗体与细胞免疫反应,但是pVAX1-U-M诱导的细胞免疫反应明显高于pVAX1-M,差异显著(P<0.05);而其诱导的抗体水平明显低于pVAX1-M,二者差异也显著(P<0.05)。【结论】泛素在一定程度上可以促进PRRSVM基因诱导细胞免疫反应,但对体液免疫未见到同样作用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 M基因 泛素 体液免疫 细胞免疫 DNA疫苗

原文传递

赤羽病毒G1基因的真核表达及抗原性检测 被引量：1

14

作者 徐树兰 童铁钢 +4 位作者 白宇 王群 张维军 孙庆歌 吴东来 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期440-444,共5页

通过RT-PCR获得赤羽病毒(AKAV)OBE-1株的G1基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的pFastBacHTA转移载体质粒中,利用Tn7转座子与穿梭载体BacmidDNA同源重组,获得了重组... 通过RT-PCR获得赤羽病毒(AKAV)OBE-1株的G1基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的pFastBacHTA转移载体质粒中,利用Tn7转座子与穿梭载体BacmidDNA同源重组,获得了重组杆状病毒DNA,用CELLFECTIN介导其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BAC-G1P1。SDS-PAGE结果表明,感染BAC-G1P1后的Sf9昆虫细胞表达可溶形式的120ku目的蛋白,其大小与预期相符。Western blot和间接免疫荧光试验显示表达产物具有良好的免疫学活性。 展开更多

关键词 赤羽病毒 G1基因 表达

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人分化抑制因子Id-2基因在大肠埃希氏菌中的高效表达及其多克隆抗体的制备 被引量：1

15

作者 童铁钢 林燕 +4 位作者 穆丹梅 白宇 杨木蕾 郑敏 吴东来 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期1094-1097,1110,共5页

目的在大肠杆菌中表达人Id-2与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人Id-2的多克隆抗体。方法从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增出Id-2基因的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆... 目的在大肠杆菌中表达人Id-2与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人Id-2的多克隆抗体。方法从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增出Id-2基因的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Id-2蛋白,SDS-PAGE分析表达产物。通过亲和层析法纯化表达的GST-Id-2融合蛋白,Western-Blot检测重组抗原的免疫原性,并以此为抗原制备多克隆抗体。结果经PCR、酶切、测序鉴定证明,Id-2基因已正确克隆至pGEX-6P-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量40000的GST-Id-2融合蛋白。Western-Blot、ELISA和琼脂双向扩散实验鉴定所制备的多克隆抗体可以与GST-Id-2特异性反应。结论Id-2基因在在大肠杆菌中的成功表达及制备的多克隆抗体,为检测Id-2及其在各种组织中的表达提供了一种检测方法,也为分析Id-2分子结构及抗原表位奠定了基础。 展开更多

关键词 人Id-2基因 基因表达 多克隆抗体

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猪β2-微球蛋白基因在大肠埃希氏菌中的表达与纯化

16

作者 肖一红 刘光亮 +3 位作者 童铁钢 王群 孟庆文 吴东来 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2008年第8期22-24,共3页

关键词 大肠埃希氏菌 蛋白基因 细胞特异性 自身免疫性疾病 纯化 微球 定量检测 SARS病毒

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人分化抑制因子Id-3基因在大肠埃希菌中的高效表达及其多克隆抗体的制备

17

作者 林燕 童铁钢 +4 位作者 穆丹梅 白宇 杨木蕾 郑敏 吴东来 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第23期3446-3449,共4页

目的在大肠杆菌中表达人Id-3与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人Id-3的多克隆抗体。方法从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增出Id-3的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆菌中经... 目的在大肠杆菌中表达人Id-3与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人Id-3的多克隆抗体。方法从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增出Id-3的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Id-3融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,Western-Blot检测重组抗原的免疫原性。通过亲和层析法纯化表达的GST-Id-3融合蛋白,并以此为抗原制备多克隆抗体。结果经PCR、酶切、测序鉴定证明,Id-3基因已正确克隆至pGEX-6P-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为39000GST-Id-3融合蛋白。ELISA和琼扩试验鉴定所制备的多克隆抗体可以与GST-Id-3融合蛋白发生特异性反应。结论Id-3基因在大肠杆菌中的成功表达及制备的多克隆抗体,为检测Id-3及其在各种组织中的表达水平提供了一种检测途径,也为分析Id-3分子结构、抗原表位和生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 人分化抑制因子3(Id-3) 表达 纯化 多克隆抗体

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