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一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用 被引量：4
1
作者 谢荣辉 徐芳 +7 位作者 朱函坪 程胤凯 傅桂明 姚苹苹 翁景清 卢亦愚 杨章女 朱智勇 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期277-280,共4页
目的建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎（乙脑）病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列，应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针，对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化，... 目的建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎（乙脑）病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列，应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针，对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化，验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对蚊虫样本的检测，以评价该方法的实际应用价值。结果优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0．1gmol／L探针浓度，0．2gmol／L引物浓度，5mmol／L Mg^2＋浓度。结果表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性，对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒（SEO型与HTN型）均无交叉反应，检测的灵敏度达0．1TCID50，重复性分析表明同一样品Ct值的重复检测4次，其标准差均在合理范围内，分别为0．033、0．079、0．149和0．411。对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离检测，结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性，而病毒分离则只检测出3份阳性，表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感，可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右，且操作简便、敏感性高。结论研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点，适用于乙脑病原学的快速检测。 展开更多
关键词 流行性乙型脑炎病毒 荧光定量反转录-聚合酶链反应 检测
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浙江省蚊虫中乙型脑炎病毒的分离及鉴定 被引量：4
2
作者 谢荣辉 付士红 +6 位作者 程胤凯 徐芳 姚苹苹 翁景清 朱函坪 张意坚 朱智勇 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期712-715,共4页
目的 对2007年浙江省采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 2007年在浙江省采集蚊虫标本，用金黄地鼠肾细胞（BHK-21）分离病毒，对新分离的病毒进行血清学和分子生物学鉴定。结果 采集到4735只蚊虫，分离到2株致BHK-21细胞病变的病... 目的 对2007年浙江省采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 2007年在浙江省采集蚊虫标本，用金黄地鼠肾细胞（BHK-21）分离病毒，对新分离的病毒进行血清学和分子生物学鉴定。结果 采集到4735只蚊虫，分离到2株致BHK-21细胞病变的病毒，经免疫荧光和RT—PCR试验鉴定为乙型脑炎病毒（JEV），利用病毒PrM区段进行基因分型分析，新分离的2株病毒属于基因I型JEV。对这2株病毒的E基因区段进行分析，核苷酸和氨基酸的同源性分别为99．0％和98．8％。与疫苗株SA14—14—2相比，核苷酸同源性在87，7％，氨基酸同源性在96．4％以上，共有14个共同的氨基酸位点差异。结论 在浙江省采集的蚊虫标本中分离到2株病毒，经鉴定为基因I型JEV，是浙江省近年来首次分离。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 病毒分离 序列分析
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辽宁省啮齿类动物肾综合征出血热病毒株的分离及鉴定 被引量：4
3
作者 刘芸 秦彩明 +6 位作者 姚文清 孙英伟 张稷博 程胤凯 翁景清 张全福 李建东 《中国卫生检验杂志》 CAS 2009年第7期1625-1627,1653,共4页
目的:通过对我省疫区捕获的鼠肺样本做病毒分离,初步掌握辽宁省啮齿类动物自然感染肾综合征出血热(HFRS)病毒亦称为汉坦病毒(Hantavirus,HV)的病毒型别,为今后疫区的防治工作提供可靠的依据。方法:将待检的阳性鼠肺样本分成二组,其中一... 目的:通过对我省疫区捕获的鼠肺样本做病毒分离,初步掌握辽宁省啮齿类动物自然感染肾综合征出血热(HFRS)病毒亦称为汉坦病毒(Hantavirus,HV)的病毒型别,为今后疫区的防治工作提供可靠的依据。方法:将待检的阳性鼠肺样本分成二组,其中一组直接用vero-E6细胞做病毒分离,而另一组先做动物试验将病毒增殖,然后再做vero-E6细胞传代适应;最后应用型特异性引物进行逆转录套式PCR(RT-PCR,)扩增病毒核酸,并对其M片段的靶序列核苷酸序列进行测定,从而达到对所分离的汉坦病毒进行分型及鉴定。结果:样本直接做细胞分离获得阳性病毒株3株,经动物增殖两代后获得强阳性鼠肺3份,弱阳性鼠肺1份;再转vero-E6细胞传代适应后得到阳性毒株2株,经核酸检测与序列鉴定确定了我们所分离的5株病毒株均为汉坦病毒,其中1株为汉滩型病毒(Hantaan virus,HTNV),4株为汉城型病毒(Seoul virus,SEOV)。 展开更多
关键词 汉坦病毒 病毒分离 RT-PCR 分型及鉴定 系统发生树
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浙江省蚊媒携带流行性乙型脑炎病毒的分布特点 被引量：2
4
作者 谢荣辉 张晓锋 +5 位作者 朱函坪 徐芳 姚苹苹 程胤凯 张意坚 朱智勇 《中华预防医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期282-286,共5页
目的了解浙江部分地区蚊媒及猪携带流行性乙型脑炎（乙脑）病毒情况以及浙江省存在的乙脑病毒基因型别。方法于2007年5月至10月在浙江省仙居、龙泉和慈溪3个县人房及猪舍采集蚊虫标本和猪血清，共采集10662只蚊虫和204份猪血清，蚊虫标... 目的了解浙江部分地区蚊媒及猪携带流行性乙型脑炎（乙脑）病毒情况以及浙江省存在的乙脑病毒基因型别。方法于2007年5月至10月在浙江省仙居、龙泉和慈溪3个县人房及猪舍采集蚊虫标本和猪血清，共采集10662只蚊虫和204份猪血清，蚊虫标本中以淡色库蚊和中华按蚊为主。利用病毒分离和荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测蚊虫携带乙脑病毒，应用酶联接免疫吸附剂测定（ELISA）方法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT—PCR方法对细胞分离株进行病毒鉴定；利用RT—PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM基因，并对细胞分离到的病毒进行基因分型。结果在蚊虫标本中检出7批乙脑病毒核酸阳性样本，并分离出3株病毒，经鉴定3株病毒均为乙脑病毒，基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。猪血清有121份阳性，总阳性率为59．3％。6月份有50％以上的猪血清中乙脑病毒抗体呈阳性。结论浙江省部分地区存在着乙脑的传播媒介，在蚊媒和猪中携带有乙脑病毒；采集的蚊虫标本中分离到3株病毒，经鉴定为基因I型乙脑病毒，是近年来在浙江省首次分离到的基因I型乙脑病毒。 展开更多
关键词 脑炎病毒 日本 脑炎 虫媒病毒 环境监测 基因型
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汉坦病毒Z5株M和S片段全基因序列测定及分析 被引量：2
5
作者 李婵 谢荣辉 +4 位作者 朱函坪 徐芳 姚苹苹 程胤凯 朱智勇 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期215-217,225,共4页
目的测定汉坦病毒Z5株M、S片段的全长序列,了解其分子结构特征,并分析Z5与其他汉坦病毒株的遗传学差异。方法设计引物,用RT-PCR技术扩增Z5株全长M与S片段。PCR产物纯化后克隆入T载体并测定序列及分析。结果Z5株M片段的全基因序列含有3 ... 目的测定汉坦病毒Z5株M、S片段的全长序列,了解其分子结构特征,并分析Z5与其他汉坦病毒株的遗传学差异。方法设计引物,用RT-PCR技术扩增Z5株全长M与S片段。PCR产物纯化后克隆入T载体并测定序列及分析。结果Z5株M片段的全基因序列含有3 616个核苷酸,编码1 135个氨基酸。S全基因序列含有1 700个核苷酸,编码429个氨基酸。经核苷酸与氨基酸同源性分析,Z5株应属于汉坦病毒的汉滩型(HTN型)毒株,与Z10株同属一个亚型。结论Z5株病毒和其他汉滩病毒病毒在核苷酸序列上有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍较高。 展开更多
关键词 汉坦病毒 M和S基因片段 序列分析
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浙江省基因Ⅰ型乙脑病毒全基因序列的测定及分析 被引量：2
6
作者 谢荣辉 朱函坪 +6 位作者 付士红 程胤凯 徐芳 姚苹苹 杨章女 周小龙 朱智勇 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期245-247,共3页
目的为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料，研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度，为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据。方法设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因，PCR产物纯化后克隆于T载体并... 目的为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料，研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度，为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据。方法设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因，PCR产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定。通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒XJ69和XJP613株全基因组全长均为10964个核苷酸，含有一个开放阅读框架，编码3432个氨基酸。与GenBank中选择的32株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸同源为83．5％～99．2％，氨基酸总体同源性为97．5％～99．7％。通过PrM／C区段、E区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因I型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒XJ69和XJP613株属于基因Ⅰ型，与上海三带喙库蚊分离株sH17M-07关系最为接近。 展开更多
关键词 脑炎病毒亚组 日本 序列分析 种系发生
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流行性乙型脑炎病毒非结构蛋白1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达 被引量：3
7
作者 谢荣辉 程胤凯 +4 位作者 朱函坪 翁景清 徐芳 姚苹苹 朱智勇 《中国疫苗和免疫》 CAS 2011年第1期41-44,共4页
目的获得流行性乙型脑炎(乙脑)病毒非结构蛋白1(Non-structural Protein 1,NS1)基因并在昆虫细胞中表达,为研制乙脑病毒基因工程疫苗奠定基础。方法逆转录-聚合酶链反应扩增乙脑病毒NS1基因并测序列,定向克隆入杆状病毒(Baculovirus,BV... 目的获得流行性乙型脑炎(乙脑)病毒非结构蛋白1(Non-structural Protein 1,NS1)基因并在昆虫细胞中表达,为研制乙脑病毒基因工程疫苗奠定基础。方法逆转录-聚合酶链反应扩增乙脑病毒NS1基因并测序列,定向克隆入杆状病毒(Baculovirus,BV)转移载体pFastBac HTa,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni,TN)细胞获得重组BV(rBV-NS1)。rBV-NS1感染TN细胞后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacryamide Gel Eleetrophoresis,SDS-PAG)、间接免疫荧光试验(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)和蛋白质印迹法(Western blotting,WB)检测NS1重组蛋白。结果成功克隆乙脑病毒NS1基因,SDS-PAGE、IFA和WB检测表明,NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与乙脑患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论乙脑病毒NS1在昆虫细胞中表达,为研究NS1的生物学特性和研制基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 流行性乙型脑炎病毒 非结构蛋白1 克隆 表达
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2007年浙江省鼠类感染汉坦病毒监测及病毒分离 被引量：1
8
作者 姚苹苹 徐芳 +7 位作者 朱函坪 谢荣辉 程胤凯 梅玲玲 朱智勇 邓小昭 张云 王忠灿 《中国媒介生物学及控制杂志》 CAS CSCD 2009年第4期349-351,共3页
目的了解浙江省鼠类自然感染汉坦病毒(HV)情况和病毒型别,为肾综合征出血热(HFRS)防治提供科学依据。方法采集鼠类肺组织和血清标本,用间接免疫荧光试验检测鼠血清IgG抗体,直接免疫荧光试验检测鼠肺HV抗原。HV抗原阳性鼠肺接种Vero-E6... 目的了解浙江省鼠类自然感染汉坦病毒(HV)情况和病毒型别,为肾综合征出血热(HFRS)防治提供科学依据。方法采集鼠类肺组织和血清标本,用间接免疫荧光试验检测鼠血清IgG抗体,直接免疫荧光试验检测鼠肺HV抗原。HV抗原阳性鼠肺接种Vero-E6细胞分离病毒,用HV单克隆荧光抗体鉴定分离株的型别。结果共捕获鼠形动物1129只,其中黑线姬鼠为优势种,鼠肺HV抗原阳性率为3.0%,鼠血标本IgG抗体阳性57份,阳性率8.0%。分离到6株汉滩(HTN)型病毒,其中来自黑线姬鼠5株,褐家鼠1株。结论浙江省存在以黑线姬鼠为主要传染源的HFRS疫源地,HV主要流行型别为HTN型。 展开更多
关键词 啮齿动物 汉坦病毒 监测
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Ⅱ型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达
9
作者 谢荣辉 朱函坪 +4 位作者 程胤凯 徐芳 姚苹苹 翁景清 朱智勇 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1114-1117,共4页
目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastB... 目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。 展开更多
关键词 登革病毒 非结构蛋白 克隆 真核表达
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辽宁省首次从病人血清中分离出肾综合征出血热病毒及鉴定
10
作者 刘芸 姚文清 +5 位作者 郭军巧 程胤凯 翁景清 陈丹 孙佰红 秦彩明 《中国卫生检验杂志》 CAS 2008年第5期849-850,共2页
目的:从临床确诊的肾综合征出血热(HFRS)患者血清中分离出汉坦病毒(HV),并对分离到的病毒进行分型鉴定,填补了辽宁省从人体血液中分离HFRS病毒的空白。方法:采集发病在一周内临床确诊为EHF患者的血液(急性期血)直接用VERO-E6细胞分离病... 目的:从临床确诊的肾综合征出血热(HFRS)患者血清中分离出汉坦病毒(HV),并对分离到的病毒进行分型鉴定,填补了辽宁省从人体血液中分离HFRS病毒的空白。方法:采集发病在一周内临床确诊为EHF患者的血液(急性期血)直接用VERO-E6细胞分离病毒,并用间接免疫荧光(IFAT)及RT-PCR方法对分离到的毒株进行确定和分型鉴定。结果:从2005年至2006年度全省共收集符合做病毒分离的急性期血液样本40份,其中随机选择20份样本先接种长爪沙鼠,另外20份采用VERO-E6细胞直接分离。从接种动物肺脏中未分离出病毒,直接细胞分离分出病毒株1株。结论:对于急性期病人血分离肾综合征出血热病毒采用细胞分离比动物分离的方法似乎更安全、更经济且有利于提高分离率。 展开更多
关键词 汉坦病毒(HV) 急性期血 细胞直接分离
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