目的探讨黄曲霉(A.flavus)基因敲除体系的构建和RNA依赖的RNA聚合酶1(RDRP1)基因在A.flavus生长发育中的作用。方法通过National Center for Biotechnology Information网址查找RDRP1基因,设计上下游序列引物,引入融合片段20 bp,采用重...目的探讨黄曲霉(A.flavus)基因敲除体系的构建和RNA依赖的RNA聚合酶1(RDRP1)基因在A.flavus生长发育中的作用。方法通过National Center for Biotechnology Information网址查找RDRP1基因,设计上下游序列引物,引入融合片段20 bp,采用重叠PCR(overlap PCR)法融合RDRP1基因上下游片段和嘧啶磺胺抗性基因(ptrA);采用聚乙二醇(PEG)介导方法将该融合片段导入A.flavus的原生质体中获得RDRP1阳性转化子(ptrA抗性),采用Sourthern blot鉴定筛选RDRP1基因突变菌株;对RDRP1基因突变菌株,采用十字交叉法测定生长速率、血细胞计数板统计产孢量,手动计数Wickerham Medium(WKM)+尿嘧啶尿苷(UU)培养基上产生的菌核数量。结果获得ptrA抗性转化子13个;Sourthern blot鉴定4个为RDRP1基因缺失菌株,效率30.8%;与CA14相比,RDRP1基因突变菌株在表型、生长率、产孢量及菌核发育上差异无统计学意义(P>0.05)。结论overlap PCR结合PEG介导转化的方式可短时间内获得A.flavus基因敲除突变菌株,RDRP1基因不参与A.flavus表型、生长率、产孢量及菌核发育的调控作用。展开更多
【目的】构建用于比较黄曲霉(Aspergillus flavus,A.flavus)菌株之间致病力差异的小鼠感染模型,并利用该模型评价真菌病毒AfPV1对宿主A.flavus致病力的影响。【方法】用不同浓度环磷酰胺腹腔注射Institute of Cancer Research(ICR)小鼠...【目的】构建用于比较黄曲霉(Aspergillus flavus,A.flavus)菌株之间致病力差异的小鼠感染模型,并利用该模型评价真菌病毒AfPV1对宿主A.flavus致病力的影响。【方法】用不同浓度环磷酰胺腹腔注射Institute of Cancer Research(ICR)小鼠,根据白细胞的数量判断小鼠免疫抑制程度;通过滴鼻和尾静脉两种感染方法接种不同浓度的A.flavus孢子量,统计14 d以内小鼠的死亡率,确定A.flavus最佳的孢子接种量;通过小鼠组织的菌落负荷量以及肺部组织的病理观察,确定A.flavus感染是否成功;最后利用该小鼠模型评价真菌病毒AfPV1对寄主A.flavus致病力的影响。【结果】腹腔注射环磷酰胺的浓度为250 mg/kg时,能够达到免疫抑制水平;小鼠组织真菌负荷和病理组织切片观察显示A.flavus成功感染接种的ICR小鼠组织;在滴鼻接种模型中,A.flavus的孢子接种量为40μL(1×10^(6) CFU/mL)时比较合适评价A.flavus菌株之间的差异;在尾静脉接种的模型中,A.flavus的孢子接种量在50μL(1×10^(6) CFU/mL)比较合适评价A.flavus菌株之间的差异;病毒AfPV1能够引起A.flavus的致病力下降,但是不影响A.flavus在小鼠肺部的定殖量。【结论】本研究构建的小鼠感染模型能够评价A.flavus菌株之间致病力的差异;真菌病毒AfPV1的感染降低了宿主A.flavus的致病力。展开更多
文摘【目的】构建用于比较黄曲霉(Aspergillus flavus,A.flavus)菌株之间致病力差异的小鼠感染模型,并利用该模型评价真菌病毒AfPV1对宿主A.flavus致病力的影响。【方法】用不同浓度环磷酰胺腹腔注射Institute of Cancer Research(ICR)小鼠,根据白细胞的数量判断小鼠免疫抑制程度;通过滴鼻和尾静脉两种感染方法接种不同浓度的A.flavus孢子量,统计14 d以内小鼠的死亡率,确定A.flavus最佳的孢子接种量;通过小鼠组织的菌落负荷量以及肺部组织的病理观察,确定A.flavus感染是否成功;最后利用该小鼠模型评价真菌病毒AfPV1对寄主A.flavus致病力的影响。【结果】腹腔注射环磷酰胺的浓度为250 mg/kg时,能够达到免疫抑制水平;小鼠组织真菌负荷和病理组织切片观察显示A.flavus成功感染接种的ICR小鼠组织;在滴鼻接种模型中,A.flavus的孢子接种量为40μL(1×10^(6) CFU/mL)时比较合适评价A.flavus菌株之间的差异;在尾静脉接种的模型中,A.flavus的孢子接种量在50μL(1×10^(6) CFU/mL)比较合适评价A.flavus菌株之间的差异;病毒AfPV1能够引起A.flavus的致病力下降,但是不影响A.flavus在小鼠肺部的定殖量。【结论】本研究构建的小鼠感染模型能够评价A.flavus菌株之间致病力的差异;真菌病毒AfPV1的感染降低了宿主A.flavus的致病力。
