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边鸡肠道乳酸菌的分离鉴定及筛选 被引量：6
1
作者 杨逢清 王泽炜 +5 位作者 李华斌 田崇瑜 闫芳 马海利 高文伟 田文霞 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2134-2138,2144,共6页
以边鸡的肠道内容物为材料,应用MRS琼脂双层培养基进行培养,通过菌株形态观察、革兰染色、生理生化试验、16S rDNA基因序列分析与系统发育进化分析对菌株进行分离鉴定;对分离到的菌株进行生长曲线测定及耐酸、耐胆盐试验和抑菌试验。结... 以边鸡的肠道内容物为材料,应用MRS琼脂双层培养基进行培养,通过菌株形态观察、革兰染色、生理生化试验、16S rDNA基因序列分析与系统发育进化分析对菌株进行分离鉴定;对分离到的菌株进行生长曲线测定及耐酸、耐胆盐试验和抑菌试验。结果显示,分离鉴定到3株乳酸菌(I、L和G)分别为卷曲乳杆菌、约氏乳杆菌和唾液乳杆菌。通过测定生长曲线发现I和G较L早进入对数期,生长速度较快,具有良好的生长特性;3株菌均对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性,均对低pH和胆盐环境耐受。结果表明,筛选发现I和G更适合作为研制微生态制剂的菌株,该试验为研制饲料添加剂提供优良菌株和科学依据。 展开更多
关键词 边鸡 乳酸菌 分离鉴定 筛选
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猫杯状病毒抗原检测胶体金试纸条的研制 被引量：1
2
作者 李华斌 田崇瑜 +8 位作者 李欣昱 李春和 张然 杨峰清 刘媛 贺威 谭凌云 赵忠鹏 闫芳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期483-487,503,共6页
以浓缩纯化的猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得5株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为1E2、4C3、5F11、6G9和7D2,分别制备腹水后进行纯化。以多... 以浓缩纯化的猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得5株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为1E2、4C3、5F11、6G9和7D2,分别制备腹水后进行纯化。以多克隆抗体为金标抗体,腹水ELISA和中和效价较高的单抗(4C3)作为检测线抗体,羊抗兔二抗为质检抗体,制备检测FCV病毒抗原的免疫胶体金快速诊断试纸条。在pH为7.4的条件下,金标抗体的最适质量浓度为0.1 g/L,检测线最佳包被质量浓度为1.0 g/L,质控线最终质量浓度为0.5 g/L。经检测该试纸条具有敏感性高,特异性强,稳定性好的特点,用制备的胶体金试纸条与RT-PCR方法同时对76份猫鼻咽拭子进行检测,比较两者的符合率,符合率在90%以上。结果表明,本试验研制的胶体金试纸条可以用于FCV的临床检测。 展开更多
关键词 单克隆抗体 FCV 免疫胶体金
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武装GV1001的重组溶瘤流感病毒构建及抗肿瘤作用研究
3
作者 李聪 孙芳 +6 位作者 程晋霞 田崇瑜 邓卓雅 于洪妤 田昱莹 牛燕 杨鹏辉 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期262-269,共8页
目的拯救嵌合GV1001的重组溶瘤流感病毒株,并通过体内外实验全面评价其选择性杀伤肝癌的效果。方法将编码GV1001肽的碱基序列串联重复3次序列优化设计后插入到A/PuertoRico/8/34(PR8)病毒的NA片段。采用反向遗传学技术,重组质粒pOV-GV10... 目的拯救嵌合GV1001的重组溶瘤流感病毒株,并通过体内外实验全面评价其选择性杀伤肝癌的效果。方法将编码GV1001肽的碱基序列串联重复3次序列优化设计后插入到A/PuertoRico/8/34(PR8)病毒的NA片段。采用反向遗传学技术,重组质粒pOV-GV1001-NA与pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW197-M、pHW198-NS PR87个质粒共同转染COS 1/MDCK细胞,拯救得到重组溶瘤病毒rOV-GV1001-NA。经过血凝实验、TCID_(50)、PCR、透射电镜、细胞免疫荧光等鉴定,流式细胞术检测rOV-GV1001-NA诱导肝癌细胞死亡的方式,进一步通过肝癌H22细胞小鼠皮下荷瘤模型评价rOV-GV1001-NA体内溶瘤效果。结果重组溶瘤病毒rOV-GV1001-NA血凝效价为2^(9),病毒滴度达5 LogTCID_(50)/ml,并可在SPF鸡胚中稳定传代;电镜观察形态大小符合流感病毒特点;细胞免疫荧光证明GV1001成功插入并表达;细胞凋亡实验表明rOV-GV1001-NA可选择性诱导肝癌细胞凋亡;肝癌小鼠皮下荷瘤模型证实rOV-GV1001-NA可显著抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期,且具有剂量依赖性。结论利用反向遗传学技术成功构建了武装GV1001的重组溶瘤流感病毒,体内外实验表明rOV-GV1001-NA能够靶向杀伤肝癌细胞而对正常细胞无明显影响,该结果将为肿瘤疫苗研究提供新思路,有望为肝癌临床治疗开辟新途径。 展开更多
关键词 溶瘤病毒 肝癌 GV1001 免疫疗法
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大肠杆菌性乳腺炎动物模型的建立及临床病理特征研究
4
作者 范君文 田崇瑜 +8 位作者 李华斌 史伯昌 李春和 谭凌云 李欣昱 贺威 刘媛 闫芳 赵忠鹏 《广东畜牧兽医科技》 2023年第3期42-48,共7页
为了给预防疫苗和治疗药物的有效性评价提供参考依据,该试验建立了稳定的乳房炎奶牛模型,可为广泛感染性疾病“人病兽防”理念的验证提供可靠途径。自全国不同地区取奶牛临床型乳房炎乳样,经细菌分离鉴定后,将大肠杆菌不同菌株感染6—8... 为了给预防疫苗和治疗药物的有效性评价提供参考依据,该试验建立了稳定的乳房炎奶牛模型,可为广泛感染性疾病“人病兽防”理念的验证提供可靠途径。自全国不同地区取奶牛临床型乳房炎乳样,经细菌分离鉴定后,将大肠杆菌不同菌株感染6—8周龄Balb/c小鼠和2—6岁泌乳后期健康易感奶牛,通过测定不同菌株对小鼠、奶牛的感染力和致病力,筛选出对两者均具有较强致病性的强毒株;使用强毒株攻击易感奶牛,记录奶牛攻毒前后临床表现,及日产奶量、乳汁细菌数和体细胞数的变化情况;攻击小鼠,记录小鼠攻毒前后临床表现和死亡情况,以建立稳定的大肠杆菌感染致病实验动物模型。结果表明:筛选到3株不同血清型的强毒株大肠杆菌LZ06(O6)、ESH05(O8)、EHL11(O81),能够致死小鼠并导致奶牛乳房炎疾病;建立稳定的大肠杆菌乳房炎模型和小鼠致死性模型。该试验成功筛选到导致奶牛乳房炎的大肠杆菌强毒株,建立的实验动物模型可用于大肠杆菌疫苗和治疗药物的有效性评价,为大肠杆菌引起的人兽共患病“人病兽防”理念和策略提供新的评估途径。 展开更多
关键词 大肠杆菌 奶牛乳房炎 动物模型 人病兽防
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鸡柔嫩艾美耳球虫抗体ELISA检测方法的建立 被引量：4
5
作者 田崇瑜 段小超 +4 位作者 陈彦华 霍乃蕊 韩克光 古少鹏 郑明学 《山西农业科学》 2021年第3期361-365,共5页
建立鸡柔嫩艾美耳球虫特异性抗体的ELISA检测方法,为柔嫩艾美耳球虫的免疫机制研究和口服卵黄抗体制剂研发奠定基础。以柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊免疫雏鸡制备阳性血清和可溶性抗原,优化ELISA检测条件,以阴性血清确定检测临界值,以阳... 建立鸡柔嫩艾美耳球虫特异性抗体的ELISA检测方法,为柔嫩艾美耳球虫的免疫机制研究和口服卵黄抗体制剂研发奠定基础。以柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊免疫雏鸡制备阳性血清和可溶性抗原,优化ELISA检测条件,以阴性血清确定检测临界值,以阳性抗体绘制标准曲线。结果表明,经过优化,确定包被缓冲液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH值9.6),可溶性抗原的包被质量浓度为21.46μg/mL,4℃包被16 h;3%BSA 37℃封闭2 h;待检血清和兔抗鸡IgG-HRP的最佳稀释倍数分别为20倍和500倍,阴性和阳性结果判定的临界OD_(450)值分别为0.1275和0.1210,建立的标准曲线线性关系良好(R^(2)=0.9921)。该方法的建立可为相应试剂盒的研发提供技术基础,并可促进鸡球虫抗体免疫应答研究和有效防控。 展开更多
关键词 鸡球虫病 柔嫩艾美耳球虫 ELISA 孢子化卵囊 抗体检测
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无针肌内注射免疫四价流感裂解疫苗的免疫保护效果评价
6
作者 史伯昌 田崇瑜 +8 位作者 许振国 谭凌云 李欣昱 李华斌 贺威 刘媛 闫芳 郑源强 赵忠鹏 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期382-387,共6页
采用无针肌内注射流感疫苗免疫SD大鼠和巴马小型猪,用有针肌内注射免疫作为对照,通过观察评价局部接种效果,并采用血凝抑制试验测定疫苗免疫后的血抑抗体效价及鸡胚中和试验评价中和抗体效价。结果显示,无针肌内注射30μg HA抗原量可达... 采用无针肌内注射流感疫苗免疫SD大鼠和巴马小型猪,用有针肌内注射免疫作为对照,通过观察评价局部接种效果,并采用血凝抑制试验测定疫苗免疫后的血抑抗体效价及鸡胚中和试验评价中和抗体效价。结果显示,无针肌内注射30μg HA抗原量可达到免疫的最佳效果。与有针肌内注射相比,无针肌内注射能产生对各型别病毒的更好的血凝抑制抗体和中和性抗体。结果表明,无针肌内注射四价流感裂解疫苗安全、有效,将为流感疫苗快速大规模接种提供新的策略,为无针注射免疫疫苗临床试验研究提供依据。 展开更多
关键词 无针肌内注射 流感裂解疫苗 SD大鼠 巴马小型猪
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重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达、纯化及其免疫原性
7
作者 韩慧 史伯昌 +6 位作者 李欣昱 李华斌 田崇瑜 闫芳 石艳春 郑源强 赵忠鹏 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期1065-1068,1075,共5页
目的对金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)基因定点突变体进行克隆、表达及纯化,并检测其免疫原性,为研制马抗SEB免疫球蛋白F(ab′)2制品奠定基础。方法对SEB基因序列进行定点突变和修饰以及偏性密码子优化后,构... 目的对金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)基因定点突变体进行克隆、表达及纯化,并检测其免疫原性,为研制马抗SEB免疫球蛋白F(ab′)2制品奠定基础。方法对SEB基因序列进行定点突变和修饰以及偏性密码子优化后,构建重组表达质粒pET-22b-SEB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组SEB蛋白,经离子交换层析纯化后,HPLC法检测重组SEB蛋白抗原纯度。Western blot法检测重组SEB蛋白抗原免疫活性;将不同浓度重组SEB蛋白抗原腹腔注射BALB/c小鼠,进行致病力、抗体效价、中和抗体活性检测。结果质粒pET-22b-SEB经双酶切及测序鉴定证明构建正确。纯化的重组SEB蛋白相对分子质量约28300,纯度大于90%,与天然SEB具有一致的免疫活性,且具有良好的安全性;免疫小鼠抗体效价达1∶81920,可有效诱导小鼠产生中和抗体。结论成功对SEB进行了定点突变减毒,经克隆、表达及纯化获得高纯度的重组SEB蛋白抗原,具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌肠毒素B 重组抗原 表达 纯化 免疫原性
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山西部分地区IBV的分离鉴定及S1基因进化分析 被引量：1
8
作者 李华斌 王泽炜 +4 位作者 杨逢清 田崇瑜 闫芳 马海利 高文伟 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第21期86-91,共6页
为了了解山西省部分地区鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的流行情况,试验采集山西部分地区已接种H120疫苗的7份疑似感染IBV的蛋鸡肺脏、气管、肾脏组织并进行了病毒分离,通过RT-PCR、电镜观察、血凝试验、新城... 为了了解山西省部分地区鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的流行情况,试验采集山西部分地区已接种H120疫苗的7份疑似感染IBV的蛋鸡肺脏、气管、肾脏组织并进行了病毒分离,通过RT-PCR、电镜观察、血凝试验、新城疫干扰试验鉴定病毒,并对分离得到的病毒进行SPF雏鸡感染试验、鸡胚交叉中和试验和S1基因序列同源性及遗传进化分析。结果表明:将从7份疑似病料中分离纯化的病毒经尿囊腔接种SPF鸡胚,其中有3株分离毒株可导致明显的侏儒胚,经RT-PCR鉴定为IBV,分别命名为CK/CH/SX/BEI、CK/CH/SX/ZJQ和CK/CH/SX/A。3株分离毒株在电镜下均可观察到直径为80~120 nm、有囊膜、纤突呈放射状排列的病毒粒子,经Ⅰ型磷酸酯酶C处理后均可凝集1%鸡红细胞,均可干扰新城疫病毒(NDV)复制,致使SPF雏鸡发病并诱导产生IBV特异的免疫应答,3株分离毒株与H120疫苗株抗原差异较大,3株分离毒株之间S1基因核苷酸和推导氨基酸序列同源性分别为94.9%~98.0%和93.7%~96.7%,且与H120疫苗株S1基因核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为77.4%~78.6%和76.2%~78.0%,3株分离毒株与近几年我国流行的QX型IBV毒株形成了一个密切相关的系统发育分支,但与2008年分离的IBV SX8相比显示出不同程度的变异。说明山西省部分地区流行的IBV S1基因已出现不同程度的变异,应选择适宜的疫苗进行免疫。 展开更多
关键词 鸡传染性支气管炎 分离 鉴定 交叉中和试验 S1基因 进化分析
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携带OX40L重组溶瘤病毒的构建及靶向杀伤肝癌的研究
9
作者 杨豪 邓卓雅 +6 位作者 孙芳 雷光林 程晋霞 于洪妤 田崇瑜 张绍庚 杨鹏辉 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2022年第12期2387-2397,共11页
目的拯救携带OX40L的重组溶瘤流感病毒株,全面鉴定并评价其靶向杀伤肝癌细胞的效果。方法将编码OX40L的基因片段嵌合在A/Puerto Rico/8/34(PR8)的NS片段特定位置,利用反向遗传学技术(reverse genetics,RG),与PR8流感病毒的剩余7个骨架质... 目的拯救携带OX40L的重组溶瘤流感病毒株,全面鉴定并评价其靶向杀伤肝癌细胞的效果。方法将编码OX40L的基因片段嵌合在A/Puerto Rico/8/34(PR8)的NS片段特定位置,利用反向遗传学技术(reverse genetics,RG),与PR8流感病毒的剩余7个骨架质粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、p HW196-NA、p HW197-M共转染COSⅠ/MDCK细胞,成功拯救获得重组溶瘤流感病毒,命名为r Flu-OX40L。经血凝、TCID_(50)方法测定病毒滴度;重组病毒纯化后电镜观察病毒形态特征及大小分布;检测MDCK细胞病毒生长曲线;MTS法检测重组病毒对肝癌细胞活力的影响;流式细胞术检测重组病毒诱导肝癌细胞死亡方式;利用肝癌荷瘤小鼠模型评价重组病毒r Flu-OX40L在动物体内的抗肿瘤效果。结果重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L可在鸡胚中稳定传代,HA效价达2^(7~8),病毒滴度可达7~8 Lg TCID_(50)/ml;重组病毒rFlu-OX40L与流感病毒PR8生长曲线相一致,72 h达高峰;MTS结果显示,3 MOI重组病毒可显著降低肝癌细胞活力,且对正常肝细胞无明显影响,呈时间和剂量依赖性;流式细胞结果显示,重组病毒可显著诱导肝癌细胞凋亡,呈时间和剂量依赖性;利用肝癌荷瘤小鼠模型,瘤内注射重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L较PR8、PBS对照组,小鼠脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、CD69+T细胞数量呈现显著升高趋势。结论携带OX40L的重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L在体内外均可选择性杀伤肝癌细胞,有望为肝癌的临床治疗提供新的免疫治疗策略。 展开更多
关键词 溶瘤病毒 流感病毒 RG技术 OX40L 肝癌
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