目的构建包含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)聚合酶TP区段的重组原核表达质粒,转化表达型大肠埃希菌,以自诱导培养方法获得可溶性表达,并对其进行鉴定。方法分析HBV(A型)聚合酶N-末端1-192 AA区域的DNA序列,通过网络工具(http://w...目的构建包含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)聚合酶TP区段的重组原核表达质粒,转化表达型大肠埃希菌,以自诱导培养方法获得可溶性表达,并对其进行鉴定。方法分析HBV(A型)聚合酶N-末端1-192 AA区域的DNA序列,通过网络工具(http://www.jcat.de/)在线优化,并在5′和3′端分别添加NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点后,送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行人工合成;将人工合成的TP-DNA双酶切后,插入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS进行自诱导表达。结果重组原核表达质粒pET32a(+)/POL-TP-Opt经双酶切及测序证明构建正确;在表达菌的破菌上清中有特异性表达的蛋白,相对分子质量约20 000,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,为可溶性的重组TP蛋白。结论通过自诱导培养方法,直接成功获得可溶性的重组TP蛋白,改变了长期以来依靠包涵体复性对TP蛋白相关功能进行研究的状况。展开更多
