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β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测用质粒标准样品研制
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作者 陈进 甄玉荷 +6 位作者 廉鲁昕 牛沁雅 赵红阳 卢行安 周巍 崔生辉 杨保伟 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2021年第23期9094-9102,共9页
目的研制可作为β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测质控用标准样品。方法通过检索美国国家生物技术信息中心基因库,获得β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因bla_(TEM)、bla_(PSE)、bla_(CTX-M)、bla_(CMY)和bla_(OXA)的DNA序列,构建耐药基... 目的研制可作为β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测质控用标准样品。方法通过检索美国国家生物技术信息中心基因库,获得β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因bla_(TEM)、bla_(PSE)、bla_(CTX-M)、bla_(CMY)和bla_(OXA)的DNA序列,构建耐药基因重组质粒和工程菌。将工程菌传代培养15代,同时使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和DNA测序测定确认目标基因的遗传稳定性。大量制备菌悬液,提取重组质粒,真空干燥得到质粒标准样品。使用PCR和定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)检测质粒标准样品的最低检出限。使用超微量分光光度计测定质粒标准样品的质量,RT-qPCR测定质粒作为模板扩增时的循环数(cycle threshold,Ct),以此评价标准样品的均匀性及贮藏稳定性。结果5种重组质粒DNA可在工程菌中稳定遗传且无突变发生,5种质粒DNA标准样品均匀性良好。各质粒DNA经梯度稀释后,PCR最低检出限在2.33×10^(4)~2.25×10^(6)拷贝数/μL之间,RT-qPCR最低检出限在1.93~1850拷贝数/μL之间。样品在37℃贮存14 d、4℃贮存3个月、-20℃贮存12个月稳定性良好。结论研究制备得到的β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测用质粒标准样品的目的基因遗传稳定性、标准样品的均匀性和贮存稳定性均良好。 展开更多
关键词 Β-内酰胺类抗生素 耐药基因 质粒标准样品
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