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日本蛇根草OjDFR5基因的克隆与真核表达载体的构建
1
作者 王聿晗 张艳 +2 位作者 黄菊 徐小蓉 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2023年第2期62-67,共6页
二氢黄酮醇4-还原酶具有明显的底物特异性,是类黄酮代谢途径中的关键酶,对不同花青素的合成与积累起到决定作用,直接影响植物的颜色性状。日本蛇根草是一种具有较好药用价值的研究材料。通过分子生物学方法克隆获得日本蛇根草中的二氢... 二氢黄酮醇4-还原酶具有明显的底物特异性,是类黄酮代谢途径中的关键酶,对不同花青素的合成与积累起到决定作用,直接影响植物的颜色性状。日本蛇根草是一种具有较好药用价值的研究材料。通过分子生物学方法克隆获得日本蛇根草中的二氢黄酮醇4-还原酶的编码基因,OjDFR5,并对该基因的序列进行分析,同时将其与真核表达载体pBI121进行连接,获得真核重组表达质粒pBI121-OjDFR5,并将重组质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中。研究结果一方面为该基因的功能解析奠定基础,同时也为探究日本蛇根草类黄酮代谢机制研究提供基因资源。 展开更多
关键词 二氢黄酮醇4-还原酶 日本蛇根草 OjDFR5 基因克隆 真核表达载体
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马缨杜鹃查尔酮异构酶基因RdCHI1的克隆与功能解析 被引量：3
2
作者 孙威 孙世宇 +4 位作者 陈一然 王聿晗 张艳 鞠志刚 乙引 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期2407-2418,共12页
为了研究马缨杜鹃(Rhododendrondelavayi)查尔酮异构酶(CHI)的功能,以其花朵为材料,克隆获得了1个Rd CHI1基因。通过多序列比对、系统进化分析、q RT-PCR、拟南芥的遗传转化和抗逆试验,探究Rd CHI1参与花色苷合成与抗逆的作用。结果表明... 为了研究马缨杜鹃(Rhododendrondelavayi)查尔酮异构酶(CHI)的功能,以其花朵为材料,克隆获得了1个Rd CHI1基因。通过多序列比对、系统进化分析、q RT-PCR、拟南芥的遗传转化和抗逆试验,探究Rd CHI1参与花色苷合成与抗逆的作用。结果表明,Rd CHI1的CDS序列长663 bp,编码220个氨基酸,预测其蛋白分子量为23.728k D。多序列比对分析显示,Rd CHI1与拟南芥、苜蓿CHI的相似性分别为56.52%和56.07%。开花过程中Rd CHI1的表达水平先上升后下降,在雌蕊中表达量最高,花瓣和根中相对较低。拟南芥转化试验表明,Rd CHI1可以恢复CHI突变体(tt5)缺失的花色苷与黄酮醇,使其幼苗子叶与下胚轴颜色由绿色恢复为紫色。逆境表明,Rd CHI1过表达拟南芥植株在氯化钠和甘露醇胁迫下比野生型具有更好的适应力与存活率,证明Rd CHI1在植物中具有抵抗逆境的潜在作用。 展开更多
关键词 马缨杜鹃 查尔酮异构酶 花色 花色苷 功能解析
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马缨杜鹃RdDFR1基因的克隆分析与可溶性重组蛋白的制备
3
作者 王聿晗 陈瑶 +2 位作者 黄菊 徐小蓉 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2023年第4期88-96,共9页
二氢黄酮醇4-还原酶位于类黄酮代谢途径下游,可催化二氢黄酮醇转化为对应的花色素苷,因具有底物特异性,直接影响植物颜色的呈现。通过PCR法克隆得到马缨杜鹃DFR1基因(RdDFR1),序列分析显示,RdDFR1不具有信号肽,定位在细胞质膜的可能性最... 二氢黄酮醇4-还原酶位于类黄酮代谢途径下游,可催化二氢黄酮醇转化为对应的花色素苷,因具有底物特异性,直接影响植物颜色的呈现。通过PCR法克隆得到马缨杜鹃DFR1基因(RdDFR1),序列分析显示,RdDFR1不具有信号肽,定位在细胞质膜的可能性最大,与越桔DFR的亲缘关系最近。随后,将RdDFR1与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET-32a(+)-RdDFR1,并转入大肠杆菌BL21感受态细胞中。诱导表达分析显示,重组蛋白最佳诱导表达条件为:IPTG浓度为0.25 mmol/L,15℃下诱导48 h。按照上述条件制备并纯化得到了符合实验要求的重组蛋白,为研究RdDFR1的生物学功能及性质奠定了基础。 展开更多
关键词 二氢黄酮醇4-还原酶 马缨杜鹃 基因克隆 蛋白制备
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马缨杜鹃查尔酮异构酶(RdCHI1)重组蛋白的制备及功能验证
4
作者 王聿晗 孙世宇 +2 位作者 鞠志刚 孙威 徐小蓉 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期574-582,共9页
【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔... 【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔酮异构酶RdCHI1基因的序列信息设计引物,构建其原核表达载体,优化RdCHI1可溶性重组蛋白最佳诱导表达条件,制备可溶性重组蛋白并检测其活性。【结果】成功构建RdCHI1原核表达载体,RdCHI1重组蛋白可在上清中表达,最佳诱导条件为:15℃、36 h,IPTG浓度0.35 mmol·L^(-1)。经镍柱纯化得到质量较好的RdCHI1重组蛋白,通过体外酶活反应确定,与对照组相比,RdCHI1可以更快地催化柚皮素查尔酮(Naringenin chalcone)反应生成柚皮素(Naringenin)。【结论】RdCHI1为I型CHI,可极大提高柚皮素查尔酮生成柚皮素的速率,增加黄酮类物质积累量。 展开更多
关键词 马缨杜鹃 查尔酮异构酶 原核表达载体 可溶性重组蛋白 酶活测定
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马缨杜鹃Rd3GT1的克隆及对矮牵牛花色形成的影响 被引量：1
5
作者 孙威 张艳 +3 位作者 王聿晗 徐僡 徐小蓉 鞠志刚 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期198-206,共9页
类黄酮3-O-糖基转移酶(3GT)是花色素苷生物合成途径末端的酶,负责将糖基供体转移至花青素的3-OH位置,在增加花色素苷的稳定性与水溶性方面发挥重要作用。研究马缨杜鹃3GT在花色素苷生物合成中的功能,为马缨杜鹃花色形成及调控研究奠定... 类黄酮3-O-糖基转移酶(3GT)是花色素苷生物合成途径末端的酶,负责将糖基供体转移至花青素的3-OH位置,在增加花色素苷的稳定性与水溶性方面发挥重要作用。研究马缨杜鹃3GT在花色素苷生物合成中的功能,为马缨杜鹃花色形成及调控研究奠定基础。运用 RT-PCR 技术克隆获得马缨杜鹃3GT基因(Rd3GT1)全长CDS序列,并对其进行生物信息学分析,再利用DNA重组技术完成植物表达载体pBI121-Rd3GT1的构建,利用农杆菌介导法对矮牵牛进行遗传转化,同时对再生植株进行转基因及表型鉴定,并完成基因表达量及花色素苷检测分析。结果表明,Rd3GT1全长CDS序列为1 395 bp,编码464个氨基酸。蛋白多序列比对和系统进化分析表明,Rd3GT1属于3GT家族成员。与野生型相比,转Rd3GT1的矮牵牛植株花色由白色变为粉色,花色素苷与黄酮醇的积累显著增加,同时多个类黄酮合成相关基因表达显著升高。综上,Rd3GT1在花色素苷合成过程中发挥重要功能,可用于其它植物花色改良研究。 展开更多
关键词 马缨杜鹃 克隆 Rd3GT1 遗传转化 花色素苷
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