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人胃内因子在谷氨酸棒杆菌中的表达及活性研究 被引量：1
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作者 董贵彬 潘颖越 +4 位作者 司雅楠 王新月 白仲虎 刘秀霞 杨艳坤 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期5-9,共5页
人胃内因子(GIF)在人体内具有重要的作用,主要协助VB12在小肠中的吸收,缺失将导致机体恶性贫血,同时会降低免疫力。谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为一种不产内毒素的食品级安全微生物,在药用蛋白的表达上具有巨大的优势。为了在C.glutam... 人胃内因子(GIF)在人体内具有重要的作用,主要协助VB12在小肠中的吸收,缺失将导致机体恶性贫血,同时会降低免疫力。谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)作为一种不产内毒素的食品级安全微生物,在药用蛋白的表达上具有巨大的优势。为了在C.glutamicum中进行药用蛋白GIF的表达,编码GIF的重组基因rgif被合成,且进行密码子优化以保证GIF的正常翻译。重组基因rgif成功克隆到表达载体pXMJ19上,并导入C.glutamicum成功进行GIF的表达。为了提高GIF的表达效果,采用正交试验设计对GIF的发酵条件进行优化。发现GIF在C.glutamicum中的最佳发酵条件组合为:IPTG浓度100μmol/L、诱导时机10 h、发酵时长22 h、发酵温度23℃,在该条件下GIF得到可溶性表达,且可以通过His标签被HisTrap FF柱纯化。在谷氨酸棒杆菌中表达的GIF可以通过ELISA试剂盒检测到免疫活性,且定量产量达到42.3 mg/L。根据正交试验的结果分析发现,GIF的产量随着发酵温度从23℃增加到37℃持续降低,随着诱导时机从0 h延迟到10 h持续增加,随着发酵时长从18 h增加到22 h而增加,之后降低,随着诱导剂浓度从50μmol/L增加到100μmol/L而增加,之后降低,且各因素的影响强度依次减弱。因此,根据以上结果可知适当地降低发酵温度、延迟诱导时机将是有效提高GIF可溶性表达的研究方向。研究首次用原核生物表达GIF,为GIF的原核表达提供了一种可行的方案。 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 人胃内因子 表达 正交优化 ELISA
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毕赤酵母GT1的原核表达与体外功能鉴定
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作者 潘颖越 董贵彬 +5 位作者 王荣斌 刘国强 刘春立 刘秀霞 白仲虎 杨艳坤 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期47-51,共5页
为了开展体外互作实验,以pXMJ19质粒为载体构建pXMJ19-gt1-His重组质粒,通过单因素优化实验获得毕赤酵母甘油转运体GT 1的最优表达宿主为C41(DE3);最优表达条件为OD 600达到0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷... 为了开展体外互作实验,以pXMJ19质粒为载体构建pXMJ19-gt1-His重组质粒,通过单因素优化实验获得毕赤酵母甘油转运体GT 1的最优表达宿主为C41(DE3);最优表达条件为OD 600达到0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),于30℃、110 r/min诱导10 h。通过超速离心验证了部分GT1蛋白在大肠杆菌中位于细胞质膜上,并筛选得到针对GT1重溶解率最高的去垢剂NP-40。在去垢剂环境下通过镍离子亲和层析纯化得到GT1蛋白,然后利用等温滴定量热法体外检测其与甘油的结合能力,结果表明:GT1与甘油在体外相互作用产生放热反应,且测得其与甘油的平衡解离常数K D值为6.58μmol/L。实验说明原核表达的GT1蛋白具有活性,且与甘油的体外相互作用明显,为GT1以甘油为配体进行结晶以及解析其三维结构提供了研究基础。 展开更多
关键词 巴斯德毕赤酵母 甘油转运体 膜蛋白表达 MFS蛋白超家族 蛋白-分子相互作用
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