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铜绿假单胞菌PA0861突变菌株表达谱检测分析 被引量：6
1
作者 李九龙 郭嘉义 +3 位作者 张燕 陈一帆 满耕孝 黄卫东 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第6期495-499,504,共6页
目的分析铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1及PA0861突变菌株基因表达谱,探讨铜绿假单胞菌中GGDEFEAL基因PA0861的生物学功能。方法以野生型铜绿假单胞菌PAO1及PA0861基因转座子插入失活的突变体菌株为材料,利用结晶紫染色方法进行细菌生物膜... 目的分析铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1及PA0861突变菌株基因表达谱,探讨铜绿假单胞菌中GGDEFEAL基因PA0861的生物学功能。方法以野生型铜绿假单胞菌PAO1及PA0861基因转座子插入失活的突变体菌株为材料,利用结晶紫染色方法进行细菌生物膜的表型分析;利用Microarray技术分析其基因表达谱的变化;采用半定量RT-PCR验证Microarray结果。结果 PA0861突变株生物膜的合成量在4、8、12h均高于PAO1(P<0.05),在12h时增加了近1倍;利用Microarray技术筛选出差异表达基因517个,其中319个上调,198个下调。生物分子功能注释和Pathway分类显示这些差异表达基因除涉及代谢过程中基本的物质变化和能量转换外,突变体PA0861中涉及铁载体生物合成基因的表达增高。半定量RT-PCR验结果一致。结论铜绿假单胞菌突株PA0861基因表达谱发生改变,其中铁载体生物合成基因高表达,提示c-di-GMP可能通过对铁载体的调控影响细菌生物膜的形成。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 C-DI-GMP MICROARRAY 生物膜 铁载体
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铜绿假单胞菌PAO1中4个具有GGDEF-EAL结构域基因的研究 被引量：1
2
作者 满耕孝 陈一帆 +2 位作者 张燕 黄婷 黄卫东 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2016年第3期215-219,224,共6页
目的对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生型PAO1中与环鸟苷二磷酸(C-di-GMP)代谢相关的4个具有GGDEF-EAL结构域基因(PA0285、PA0575、PA5295、PA5442)进行初步研究。方法分析4个基因的转座子突变菌株进行生物膜(Biofilm)及... 目的对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生型PAO1中与环鸟苷二磷酸(C-di-GMP)代谢相关的4个具有GGDEF-EAL结构域基因(PA0285、PA0575、PA5295、PA5442)进行初步研究。方法分析4个基因的转座子突变菌株进行生物膜(Biofilm)及泳动性(Motility);利用PCR对4个基因的催化结构域进行克隆并构建原核表达载体,经IPTG诱导后检测重组蛋白的表达情况。结果生物膜分析显示,PA0285、PA0575、PA5442的转座子突变体较野生型PAO1间生物膜合成发生变化,其A值差异有统计学意义(P=0.000,P<0.05);PA5295转座子突变体与PAO1间生物膜合成差异无统计学意义(P=0.232,P>0.05);泳动性分析显示,PA0285、PA0575、PA5442的转座子突变体菌落直径与PAO1比较差异有统计学意义(P=0.000,P<0.05),PA5295的转座子突变体与PAO1间比较差异无统计学意义(P=0.083,P>0.05)。4个基因的催化结构域原核表达载体构建成功,并在大肠埃希菌中表达目的蛋白。结论初步分析表明PA0285、PA0575、PA5442均影响细菌的生物膜合成及运动性,为4基因的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 C-DI-GMP GGDEF-EAL 基因研究
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应用Bac-to-Bac系统高效表达人类错配修复基因hMLH1及其错义突变体
3
作者 郭嘉义 张燕 +2 位作者 满耕孝 朱明星 黄卫东 《宁夏医科大学学报》 2017年第10期1151-1154,共4页
目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中实现人类错配修复基因h MLH1及其错义突变体的高效表达。方法分别用Bam HI和Not I双酶切构建于pc DNA载体中的全长野生型h MLH1基因及T117M和V384D错义突变型DNA片段,回收后定向克隆... 目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中实现人类错配修复基因h MLH1及其错义突变体的高效表达。方法分别用Bam HI和Not I双酶切构建于pc DNA载体中的全长野生型h MLH1基因及T117M和V384D错义突变型DNA片段,回收后定向克隆至p Fast Bac1转座载体中,经酶切鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,PCR方法筛选阳性菌落,提取重组Bacmid,反复感染Sf9昆虫细胞,用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定目的蛋白的表达。结果提取转染72h后的Sf9细胞总蛋白,用7%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见分子量为85k Da清晰的蛋白条带,经Western blot方法证实该条带为h MLH1基因的表达产物。结论利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中大量表达出h MLH1野生型和T117M及V384D错义突变体蛋白,为进一步开展体外错配修复实验奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 HMLH1基因 T117M错义突变 V384D错义突变 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 Sf9昆虫细胞
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