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靶向CD7的嵌合抗原受体NK-92MI细胞对CD7阳性血液系统恶性肿瘤细胞的杀伤作用 被引量：4
1
作者 朱欣颖 刘欣 +6 位作者 王兴兵 汪安友 汪敏 刘纳纳 游凤涛 潘桂芳 杨林 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期1367-1375,共9页
目的:探讨特异性靶向CD7分子的嵌合抗原受体(CD7-CAR)修饰的NK-92MI细胞对CD7阳性血液系统恶性肿瘤细胞的杀伤作用。方法:分别收集5例CD7^+的急性T淋巴细胞白血病(acute T-lymphoblastic leukemia,T-ALL)、10例急性髓细胞白血病(acute m... 目的:探讨特异性靶向CD7分子的嵌合抗原受体(CD7-CAR)修饰的NK-92MI细胞对CD7阳性血液系统恶性肿瘤细胞的杀伤作用。方法:分别收集5例CD7^+的急性T淋巴细胞白血病(acute T-lymphoblastic leukemia,T-ALL)、10例急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)和6例T细胞淋巴瘤三类血液系统恶性肿瘤细胞,经实验室离心处理、培养后检测肿瘤细胞表面靶标的表达水平;应用7-AAD、CD56-APC、CD3-FITC、IgG Fc-PE流式细胞术检测NK-92MI和CD7-CAR-NK-92MI细胞的转染效率;使用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit检测CD7-CAR-NK-92MI细胞对CD7阳性血液肿瘤细胞的体外杀伤效率。用CBA试剂盒检测杀伤后NK-92MI和CD7-CAR-NK-92MI细胞因子白介素-2(IL-2)、干扰素(IFN-γ)及颗粒酶B的分泌差异。结果:CD7-CAR修饰的NK-92MI细胞对CD7^+T-ALL、AML、T细胞淋巴瘤肿瘤细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的阴性对照组NK-92MI细胞,其差异具有统计学意义(P<0.05);与未被修饰的NK-92MI细胞相比,经CD7-CAR修饰的NK-92MI细胞分泌的细胞因子中,IFN-γ和颗粒酶B的水平明显升高(P<0.05)。结论:经CD7-CAR修饰的NK-92MI细胞对CD7^+T-ALL、AML和T淋巴瘤细胞的杀伤效率显著提高,且具有特异性靶向作用。 展开更多
关键词 CD7 血液系统恶性肿瘤 过继免疫治疗 嵌合抗原受体 NK-92MI
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CD28突变的CAR T细胞疗法展现出良好的安全性 被引量：1
2
作者 张亭亭 王恬 +10 位作者 游凤涛 李自宣 田帅雨 张凯露 盛斌捷 吴海 安钢力 孟会敏 汪敏 王兴兵 杨林 《现代免疫学》 CAS 北大核心 2022年第6期474-481,共8页
为改善CD19靶向的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞治疗后潜在的细胞因子风暴问题,提高临床应用的安全性,将CD28共刺激结构域中的YMNM和PYAP基序双突变,并分别构建包含CD28结构域(19-CD28)和CD28突变结构域(19-C... 为改善CD19靶向的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞治疗后潜在的细胞因子风暴问题,提高临床应用的安全性,将CD28共刺激结构域中的YMNM和PYAP基序双突变,并分别构建包含CD28结构域(19-CD28)和CD28突变结构域(19-CD28M)的CD19-CAR,利用慢病毒载体构建CD19-CAR T细胞和CD19-CAR Jurkat细胞。将CD19-CAR Jurkat细胞株与肿瘤细胞共孵育来验证CD19-CAR对Jurkat细胞的特异性活化效果,随后检测CD19-CAR T细胞与靶细胞共孵育后的细胞毒性和细胞因子释放量。结果显示,与对照组比较,19-CD28-CAR Jurkat细胞和19-CD28M-CAR Jurkat细胞与Raji(CD19~+)细胞共孵育后CD69表达水平上调60%以上,CD25表达水平上调10%左右。在效应细胞∶靶细胞分别为0.5∶1、1∶1、5∶1的条件下,19-CD28-CAR T细胞和19-CD28M-CAR T细胞诱导Raji(CD19~+)细胞的凋亡率比对照组分别增加了15%、25%和40%左右,并于效应细胞∶靶细胞为5∶1时达到饱和。与此同时,19-CD28M-CAR T细胞释放细胞因子Granzyme B、IFN-γ、IL-2、TNF-α的量分别下降了14%、28%、34%和33%。该研究提示,CD28共刺激结构域突变的CD19-CAR T细胞毒性并未减弱,同时安全性显著增强。 展开更多
关键词 嵌合抗原受体修饰的T细胞 CD28突变 细胞因子释放综合征
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靶向CD19的CAR修饰的NK细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤 被引量：2
3
作者 袁园 秦扬 +9 位作者 游凤涛 陈丹 邹建炫 朱学军 李炳宗 袁磊 孟会敏 张波桢 安钢力 杨林 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期613-619,共7页
目的:利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,探讨以CD19 scFv序列构建CD19-CAR(p CD19-CAR)修饰的NK细胞对CD19^+B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用。方法 :用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序法获得抗体的序列... 目的:利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,探讨以CD19 scFv序列构建CD19-CAR(p CD19-CAR)修饰的NK细胞对CD19^+B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用。方法 :用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序法获得抗体的序列。分析抗体序列,并通过基因合成和分子克隆技术构建pCD19-CAR片段,然后将其克隆到慢病毒载体上,病毒包装制备后,转染NK-92MI细胞。最后,用流式细胞术检测不同的pCD9-CAR-NK-92MI细胞对CD19^+细胞的杀伤率。结果:(1)成功筛出特异性强的CD19单克隆抗体-pCD19;(2)抗体检测结果显示CD19+的Ramos细胞的阳性率为84.3%,Raji为85.6%,与商业化抗体结果相似;(3)被pCD19-CAR修饰的CD19-CAR阳性率为28.72%的NK-92MI细胞对CD19^+的Ramos和Raji细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的NK-92MI细胞株对Ramos和Raji细胞的杀伤率[(47.1±1.7)%vs(24.7±6.2)%和(51.8±7.9)%vs(27.6±9.6)%,均P<0.05];对CD19-细胞Jurkat,不论是未被pCD19-CAR修饰的NK-92MI或是被修饰的NK-92MI细胞,几乎都不存在特异性杀伤作用[(16.1±0.7)%vs(17.7±2.9)%,P>0.05]。结论:成功构建pCD19-CAR,被pCD19-CAR修饰的NK-92MI细胞能特异性的识别CD19抗原并杀伤CD19^+B细胞淋巴瘤细胞。 展开更多
关键词 单克隆抗体 嵌合抗原受体 NK-92MI细胞 CD19 B细胞淋巴瘤
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CD7纳米抗体衍生的CAR-T细胞对CD7阳性急性髓系白血病细胞的杀伤活性 被引量：1
4
作者 范双双 张亭亭 +7 位作者 王恬 盛斌捷 游凤涛 陈丹 翟晓晨 安钢力 孟会敏 杨林 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期852-859,共8页
目的:针对CD7阳性的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞开发一种新型的CD7嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD7-CAR-T),观察其对CD7阳性AML细胞的杀伤作用。方法:基于CD7纳米抗体序列、CD28和4-1BB共刺激域序列构建CD7-CAR慢病毒... 目的:针对CD7阳性的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞开发一种新型的CD7嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD7-CAR-T),观察其对CD7阳性AML细胞的杀伤作用。方法:基于CD7纳米抗体序列、CD28和4-1BB共刺激域序列构建CD7-CAR慢病毒载体,包装病毒颗粒并与CD7蛋白阻断剂(protein expression blocker,PEBL)慢病毒共感染人T细胞,制备CD7-CAR-T;应用实时无标记动态细胞分析技术(real time cellular analysis,RTCA)验证CD7-CAR-T对CD7过表达的293T细胞的特异性杀伤能力,流式细胞术检测CD7-CAR-T对CD7高、中、低表达的AML细胞(KG-1、HEL、Kasumi-1细胞)的增殖和细胞因子分泌的影响。结果:成功构建CD7-CAR-T细胞并阻断其表面CD7的表达,与T细胞相比,CD7-CAR-T细胞可以抑制CD7-293T细胞的增殖并促进其分泌TNF、Granzyme B和INF-γ,可显著促进CD7阳性的KG-1细胞和HEL细胞的凋亡(t=147.1、P<0.01;t=23.57、P<0.01)和细胞因子分泌(P<0.05或P<0.01),而对低表达CD7的Kasumi-1细胞无显著影响(t=0.7058、P>0.05)。结论:CD7-CAR-T细胞能够特异性杀伤CD7阳性的AML细胞。 展开更多
关键词 嵌合抗原受体修饰的T细胞 CD7 急性髓系白血病 凋亡
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PD-1和TIM-3在胃癌病人免疫组织CD3^+T细胞中的表达分析 被引量：10
5
作者 宗云辉 何宋兵 +7 位作者 游凤涛 叶思思 李亚芬 汤金乐 孟会敏 安钢力 张幸鼎 杨林 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期902-905,共4页
目的探讨在胃癌病人外周血、癌旁组织和肿瘤组织中T细胞上PD-1和TIM-3的表达状况及意义。方法应用流式细胞术检测来自胃癌病人外周血、癌旁组织和肿瘤组织及正常供体外周血的CD3+T细胞,分析PD-1和TIM-3的表达水平。结果PD-1和TIM-3在胃... 目的探讨在胃癌病人外周血、癌旁组织和肿瘤组织中T细胞上PD-1和TIM-3的表达状况及意义。方法应用流式细胞术检测来自胃癌病人外周血、癌旁组织和肿瘤组织及正常供体外周血的CD3+T细胞,分析PD-1和TIM-3的表达水平。结果PD-1和TIM-3在胃癌病人T细胞上表达水平明显高于正常供体。相比胃癌病人外周血,肿瘤组织TIL的PD-1和TIM-3表达水平更高。另外,PD-1和TIM-3的表达水平与胃癌病人的年龄和肿瘤大小存在相关性。通过阻断PD-1和TIM-3信号通路可以增强TIL抗肿瘤细胞毒性。结论 PD-1和TIM-3可能与胃癌的恶变有关。单克隆抗体靶向阻断PD-1和TIM-3通路有希望成为胃癌免疫治疗的新方法。 展开更多
关键词 胃癌 PD-1 TIM-3 共抑制因子
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嵌合体抗原受体修饰的T细胞对CD19^+套式淋巴瘤细胞的杀伤 被引量：6
6
作者 姜丽翠 游凤涛 +4 位作者 宗云辉 孟会敏 安钢力 张波桢 杨林 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期277-282,共6页
目的探讨靶向CD19分子的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD19-CAR-T)与未被基因修饰的T细胞相比,是否可以提高对CD19+的套式淋巴瘤细胞的杀伤率。方法通过基因合成和分子克隆手段构建CD19-CAR片段,将CD19-CAR片段克隆到慢病毒载体上,然后用慢... 目的探讨靶向CD19分子的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD19-CAR-T)与未被基因修饰的T细胞相比,是否可以提高对CD19+的套式淋巴瘤细胞的杀伤率。方法通过基因合成和分子克隆手段构建CD19-CAR片段,将CD19-CAR片段克隆到慢病毒载体上,然后用慢病毒对T细胞进行转染。利用PCR、蛋白免疫印迹、流式细胞术检测目的蛋白在T细胞上的表达。最后用流式细胞术检测T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。结果未被基因修饰的T细胞对CD19阳性的Jeko-1、Rec-1、Maver-1细胞的杀伤效率分别为30%、17%和32%,而CAR-T细胞对上述3种肿瘤细胞的杀伤效率分别为78%、60%和75%。未被基因修饰的T细胞对CD19阴性的293T细胞的杀伤效率为13%,CAR-T细胞对293T细胞的杀伤效率为24%。结论经CD19嵌合抗原受体修饰的T细胞可特异性识别CD19分子,对CD19阳性的套式淋巴肿瘤细胞的杀伤效率显著高于未被基因修饰的T细胞,显示出CD19-CAR-T在套式淋巴细胞肿瘤免疫治疗的巨大潜力。 展开更多
关键词 嵌合抗原受体 T细胞 CD19 套式淋巴瘤
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嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤 被引量：3
7
作者 孔潇 秦扬 +6 位作者 李甲璐 游凤涛 朱学军 袁磊 孟会敏 安钢力 杨林 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期620-625,共6页
目的:探讨用特异性靶向HER2抗原的嵌合抗原受体(HER2-CAR)修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率。方法:通过PCR获得HER2-CAR片段,运用常规分子克隆技术,将其构建到慢病毒载体上,利用包装的慢病毒颗粒对NK-92MI细胞进行转染... 目的:探讨用特异性靶向HER2抗原的嵌合抗原受体(HER2-CAR)修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率。方法:通过PCR获得HER2-CAR片段,运用常规分子克隆技术,将其构建到慢病毒载体上,利用包装的慢病毒颗粒对NK-92MI细胞进行转染;应用流式细胞术检测细胞转染效率以及转染前后NK-92MI的IFN-γ和颗粒酶分泌差异;使用7-AAD和流式细胞术体外检测HER2-CAR-NK92MI细胞对乳腺癌细胞的杀伤效率;构建小鼠乳腺癌原位肿瘤模型进行体内细胞毒性的检测。结果:用HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌肿瘤细胞MCF-7和T47D的杀伤效率明显高于未被基因修饰的NK-92MI细胞[分别为(62.4±1.3)%vs(22.1±1.2)%和(50.0±1.9)%vs(16.9±0.6)%,P<0.01];而两者对HER2阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-468的杀伤效率没有明显差异[(13.6±1.4)%vs(12.7±0.8)%,P>0.05]。同时,经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞相比未被基因修饰的NK-92MI细胞,IFN-γ的分泌明显升高(P<0.01)。结论:经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率明显提高,且具有特异性靶向,此为治疗乳腺癌等恶性肿瘤提供了临床依据。 展开更多
关键词 乳腺癌细胞 NK-92MI细胞 HER2嵌合抗原受体(HER2-CAR)
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靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制备及其体外活性测定 被引量：3
8
作者 毛春燕 安钢力 +4 位作者 王祥岭 翟晓晨 孟会敏 游凤涛 杨林(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期558-562,573,共6页
目的:构建基于EGFR纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR肿瘤细胞的细胞毒作用。方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR的纳米抗体7D12以二价的形式,通过柔性连接肽(G4S)4与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL连接,构建原... 目的:构建基于EGFR纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR肿瘤细胞的细胞毒作用。方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR的纳米抗体7D12以二价的形式,通过柔性连接肽(G4S)4与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体p ET28a-BI7D12-PE38KDEL。然后将其转化到BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达。通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并经Western blot验证。通过流式细胞技术检测该免疫毒素与EGFR阳性细胞A549、HT29、MCF-7和EGFR阴性细胞CEM、Jurkat的结合能力后,将其按照一定的浓度梯度进行细胞毒实验研究,72 h后,使用WST-1试剂检测BI7D12-PE38KDEL对上述细胞的杀伤效果。结果:通过SDS-PAGE和Western blot实验验证,成功的制备了重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该毒素大部分以可溶性的方式表达。BI7D12-PE38KDEL能够与EGFR阳性的A549、HT29、MCF-7肿瘤细胞特异性的结合,并且对上述细胞的细胞毒作用与阴性对照组CEM和Jurkat相比具有极其显著性差异(P<0.01)。结论:成功地构建了基于EGFR纳米抗体的重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该免疫毒素能特异性的结合并杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞。 展开更多
关键词 表皮生长因子受体 纳米抗体7D12 免疫毒素 铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL
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建立改良型人NK细胞体外扩增技术 被引量：2
9
作者 李亚芬 周如苑 +5 位作者 孟会敏 安钢力 宗云辉 游凤涛 张波桢 杨林 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期250-254,共5页
目的建立一种改良型的NK细胞扩增技术。方法分离4名健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用工程细胞p APC-mb IL-21和IL-2对NK细胞进行体外扩增,应用细胞计数法和流式细胞术分别比较NK细胞的扩增倍数和N... 目的建立一种改良型的NK细胞扩增技术。方法分离4名健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用工程细胞p APC-mb IL-21和IL-2对NK细胞进行体外扩增,应用细胞计数法和流式细胞术分别比较NK细胞的扩增倍数和NK细胞纯度,并采用CFSE/7-AAD法对肿瘤细胞K562和RPMI-8226进行细胞毒性实验检测杀伤效率。结果经过21 d的刺激培养,NK细胞平均扩增至409.4倍,细胞纯度最高可达95.86%。杀伤实验结果显示,扩增的NK细胞对K562细胞杀伤率高达85.2%。结论 p APC-mb IL-21工程细胞联合IL-2能够在体外高效的扩增出具有较高杀伤活性的NK细胞,可以为NK细胞免疫治疗奠定基础。 展开更多
关键词 NK细胞 体外扩增 p APC-mb IL-21 免疫治疗
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