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猪lipasin基因的克隆及其对肝细胞LPL基因转录的影响
1
作者 李曼曼 温丙言 +3 位作者 朱河水 钟凯 杨国宇 王月影 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期411-416,共6页
旨在克隆猪lipasin基因,并检测其对肝细胞LPL基因转录的影响。本试验利用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因,构建其真核表达载体转入肝细胞,探讨其对LPL基因转录的影响。结果表明,成功克隆了猪lipasin基因,目的片段大小为615bp,上传至G... 旨在克隆猪lipasin基因,并检测其对肝细胞LPL基因转录的影响。本试验利用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因,构建其真核表达载体转入肝细胞,探讨其对LPL基因转录的影响。结果表明,成功克隆了猪lipasin基因,目的片段大小为615bp,上传至GenBank(登录号:KF017598),开放阅读框为594bp,编码197个氨基酸,liapsin蛋白的分子量和等电点分别为21.99ku和6.79;成功构建了真核表达载体PB-EGFP-lipasin,实现lipasin基因在肝细胞中的过表达,与对照组相比,PB-EGFP-lipasin转染的细胞中LPL基因的转录水平显著下降。结果提示,猪lipasin可能通过抑制肝细胞LPL的转录影响脂代谢。 展开更多
关键词 lipasin 猪 克隆 肝细胞 LPL
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猪EP1基因的克隆与原核表达
2
作者 杜丽丽 李赛赛 +3 位作者 温丙言 王江 王月影 钟凯 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期930-935,940,共7页
为进一步体外研究EP1基因的生物学功能,本试验对EP1基因进行了组织分布分析。以猪骨髓cDNA为模板克隆了猪EP1基因的开放阅读框,对克隆的基因序列进行了序列分析,用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-LI... 为进一步体外研究EP1基因的生物学功能,本试验对EP1基因进行了组织分布分析。以猪骨髓cDNA为模板克隆了猪EP1基因的开放阅读框,对克隆的基因序列进行了序列分析,用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-LIC中。用菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序,将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。丙酸钠诱导表达His6-MBP-EP1融合蛋白,并用Western blot进行鉴定。结果显示:本试验成功克隆了猪EP1基因,长度为651bp,猪EP1基因在骨髓中的表达量很高;构建了EP1丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-EP1;His6-MBP-EP1融合蛋白在裂解菌液的上清中表达,相对分子质量为65560。结果表明,运用大肠杆菌表达系统成功表达EP1基因融合蛋白,为进一步在体外开展猪EP1基因生物学功能的研究提供基础。 展开更多
关键词 猪EP1基因 非酶连接 丙酸诱导 原核表达
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猪肠黏膜保护因子HO-1的短小芽孢杆菌表达系统建立与分析 被引量：1
3
作者 刘靖松 付京城 +7 位作者 温丙言 杨彦宾 郭爽 焦显芹 陈瑾 黄若超 王月影 李和平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2064-2071,共8页
【目的】对猪黏膜保护因子——血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因进行克隆及原核表达,为研究高表达HO-1在肠黏膜损伤中的保护作用提供技术支持。【方法】根据GenBank中公布的HO-1序列(登录号:NM_001004027.1),利用Primer Premi... 【目的】对猪黏膜保护因子——血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因进行克隆及原核表达,为研究高表达HO-1在肠黏膜损伤中的保护作用提供技术支持。【方法】根据GenBank中公布的HO-1序列(登录号:NM_001004027.1),利用Primer Premier 6.0设计1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增HO-1基因片段,将其与pMD19-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行PCR鉴定;将载体pNCMO2与重组载体pMD19-T-HO-1进行SalⅠ和KpnⅠ双酶切,使用T4 DNA连接酶连接,利用电击转化技术将重组表达载体pNCMO2-HO-1转入感受态短小芽孢杆菌,使用IPTG进行诱导表达,应用SDS-PAGE和Western blotting分析HO-1在短小芽孢杆菌中的融合表达情况。【结果】猪HO-1基因全长897 bp,编码298个氨基酸。双酶切后在约5200和897 bp处分别观察到pNCMO2载体片段和HO-1基因片段,证明成功构建基因表达载体pNCMO2-HO-1;电转后的双酶切结果表明,在相同的位置观察到pNCMO2和HO-1片段,证明重组表达载体pNCMO2-HO-1成功导入短小芽孢杆菌。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果发现,在36.5 ku处出现了明显的蛋白印迹,表明成功表达了HO-1的重组蛋白,且为胞外分泌。【结论】本研究成功构建了HO-1的重组原核表达载体,pNCMO2-HO-1重组载体可以在短小芽孢杆菌中诱导表达。 展开更多
关键词 血红素加氧酶1(HO-1) 肠黏膜保护因子 短小芽孢杆菌 表达系统 重组蛋白
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