目的:在毕赤酵母中表达新疆家蚕抗菌肽基因(Cecropin-XJ)并检测其活性。方法:根据作者实验室已克隆获得的新疆家蚕抗菌肽Cecropin-XJ基因设计引物,通过PCR方法扩增Cecropin-XJ,将PCR产物和表达载体pPIC9K用EcoRⅠ及NotⅠ双酶切,构建重...目的:在毕赤酵母中表达新疆家蚕抗菌肽基因(Cecropin-XJ)并检测其活性。方法:根据作者实验室已克隆获得的新疆家蚕抗菌肽Cecropin-XJ基因设计引物,通过PCR方法扩增Cecropin-XJ,将PCR产物和表达载体pPIC9K用EcoRⅠ及NotⅠ双酶切,构建重组表达质粒pPIC9K-Cecropin-XJ,酶切及测序正确后,电转化到毕赤酵母GS115,对分泌表达的重组蛋白进行活性检测。结果:PCR扩增获得192 bp Cecropin-XJ,成功构建pPIC9K-Cecropin-XJ,优化诱导条件证明在pH 6的BMMY培养液中,0.5%甲醇诱导约48h后,获得的表达产物活性较强,对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抗菌活性,在100℃条件下,其活性可维持100min以上。结论:新疆家蚕抗菌肽在毕赤酵母中分泌表达,为大规模发酵生产奠定了基础。展开更多
目的:原核表达盐穗木(Halostachys caspica C. A. Mey.)金属硫蛋白HcMT并探究其抗氧化活性。方法:构建原核表达载体pET-32a-HcMT,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,加入Zn胁迫培养(终浓度为200μmol/L),分离纯化得到Zn-HcMT,测定Zn-...目的:原核表达盐穗木(Halostachys caspica C. A. Mey.)金属硫蛋白HcMT并探究其抗氧化活性。方法:构建原核表达载体pET-32a-HcMT,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,加入Zn胁迫培养(终浓度为200μmol/L),分离纯化得到Zn-HcMT,测定Zn-HcMT自由基清除活性和总抗氧化能力,制备复合物Zn-HcMT/TiO_(2)并做FTIR表征。结果:通过原核表达获得融合蛋白Zn-HcMT,对·OH、O_(2)·^(-)、DPPH自由基具有较强的清除活性,对·OH、O_(2)·^(-)的IC分别为0.386 mg/mL、0.038 mg/mL。融合蛋白浓度为0.01 mg/mL时,对DPPH清除率达(37.43±0.006 8)%,浓度为0.3mg/mL时TEAC(trolox-equivalent antioxidant capacity)值为(1.023±0.01)mmol/L,融合蛋白还原力A_(700)为0.142±0.055,FTIR图谱同时表现了Zn-HcMT和TiO吸收特性。结论:Zn-HcMT具有良好的清除ROS活性及较强的抗氧化能力,在化妆品领域有潜在应用前景。展开更多
文摘目的:在毕赤酵母中表达新疆家蚕抗菌肽基因(Cecropin-XJ)并检测其活性。方法:根据作者实验室已克隆获得的新疆家蚕抗菌肽Cecropin-XJ基因设计引物,通过PCR方法扩增Cecropin-XJ,将PCR产物和表达载体pPIC9K用EcoRⅠ及NotⅠ双酶切,构建重组表达质粒pPIC9K-Cecropin-XJ,酶切及测序正确后,电转化到毕赤酵母GS115,对分泌表达的重组蛋白进行活性检测。结果:PCR扩增获得192 bp Cecropin-XJ,成功构建pPIC9K-Cecropin-XJ,优化诱导条件证明在pH 6的BMMY培养液中,0.5%甲醇诱导约48h后,获得的表达产物活性较强,对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抗菌活性,在100℃条件下,其活性可维持100min以上。结论:新疆家蚕抗菌肽在毕赤酵母中分泌表达,为大规模发酵生产奠定了基础。
文摘[目的]在不同p H范围内和不同时间下检测重组Hc MT结合的锌、铜离子的含量,对金属离子竞争结合金属硫蛋白的特征进行分析。[方法]构建重组表达载体,将重组质粒p ET-32a-Hc MT进行原核表达,诱导时加入Zn2+,获得菌体后超声破碎,上清中添加Cu2+,分离纯化融合蛋白Trx A-Hc MT,检测金属硫蛋白溶液紫外吸收情况。样品硝化后用ICP-OES检测金属硫蛋白结合的金属离子含量。[结果]在p H 3~9的范围内,重组Hc MT上结合的Zn2+含量随着p H值升高而升高。加入Cu2+后,重组Hc MT上结合的Cu2+浓度上升,Zn2+浓度下降。在p H 3时,重组Hc MT结合金属离子的比值Cu2+/Zn2+为最小值0.68,在p H 8时Cu2+/Zn2+为最大值1.48,有利于Cu2+竞争。当p H 8时,不同时间下Zn-Hc MT与Cu2+的竞争结果表明1 h时锌铜有竞争高峰。[结论]证明了铜离子可以取代结合在重组HcMT上的锌离子,在p H 7~9范围中结合1 h竞争效率最高,该研究为重组Hc MT在重金属解毒方面的应用奠定基础。
