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人组织型纤溶酶原激活剂表达调控及高效表达的研究——Ⅰ.t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控 被引量:4
1
作者 欧阳 黄培堂 黄翠芬 《中国科学(B辑)》 CSCD 北大核心 1994年第7期742-747,共6页
运用分子剪切技术构建了含不同长度3′端非翻译区(3′-UTR)的t-PAcDNA克隆,体外转录的mRNA在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达的结果表明t-PA mRNA 3′-UTR序列对其表达有明显抑制作用,3′-UTR缺失使t-PA表达水平提高3—8倍... 运用分子剪切技术构建了含不同长度3′端非翻译区(3′-UTR)的t-PAcDNA克隆,体外转录的mRNA在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达的结果表明t-PA mRNA 3′-UTR序列对其表达有明显抑制作用,3′-UTR缺失使t-PA表达水平提高3—8倍。进一步研究表明,t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的抑制是由3′末端长约200nt的富含AU序列所致。RNA稳定性试验证实这段富含AU的序列使t-PA mRNA稳定性下降3倍以上;将该序列插入荧光素酶(Luc)基因3′-UTR,使Luc的表达水平明显降低。分析了该序列调节t-PA表达的可能机理,提出了调控的模式。 展开更多
关键词 T-PA 基因表达 丝氨酸 蛋白酶
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t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达 被引量:6
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作者 欧阳 黄培堂 +2 位作者 徐秀英 陈琳 黄翠芬 《生物技术通讯》 CAS 1995年第1期11-15,共5页
我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过... 我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000~6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。 展开更多
关键词 人组织型纤溶酶原激活剂 CHO细胞 高效表达
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控 被引量:3
3
作者 欧阳 黄培堂 黄翠芬 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 1995年第10期950-953,共4页
人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在人体纤溶与凝血的平衡调控中发挥重要作用,而且在治疗心血管栓塞性疾病方面具有广阔的应用前景.t-PA在人体内的表达受严格调控,其mRNA具有较长的非翻译区序列.我们曾报道了t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调... 人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在人体纤溶与凝血的平衡调控中发挥重要作用,而且在治疗心血管栓塞性疾病方面具有广阔的应用前景.t-PA在人体内的表达受严格调控,其mRNA具有较长的非翻译区序列.我们曾报道了t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控,为研究长约209nt的5′-UTR序列对t-PA表达的影响.本文采用反转录-PCR技术从黑色素瘤细胞中克隆出t-PA cDNA 5′端序列,在体外和体内2个系统中研究了5-′UTR序列对t-PA表达的影响. 展开更多
关键词 纤溶酶原激活剂 非翻译区 RNA T-PA
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染研究进展 被引量:6
4
作者 欧阳 陈宁庆 《国外医学(流行病学.传染病学分册)》 北大核心 1989年第2期49-53,共5页
目前,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所致的医院内交叉感染日趋严重,已成为亟待解决的全球性公共卫生问题之一,但在我国目前尚未引起足够的重视。本文着重介绍该菌株特点、流行病学、检测技术及防治措施等问题。
关键词 耐甲氧西林 金葡球菌 感染
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重组人白细胞介素-6与肿瘤坏死因子突变体融合蛋白的构建及表达 被引量:2
5
作者 刘丽 欧阳 +1 位作者 黄培堂 刘及 《生物化学杂志》 CSCD 1996年第5期529-534,共6页
针对肿瘤坏死因子(TNF)在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上白细胞介素-6(IL-6)受体明显增高的事实,根据TNF结构与功能研究的最新信息,利用PCR技术,对人TNFα基因进行了改造,并将其与人IL... 针对肿瘤坏死因子(TNF)在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上白细胞介素-6(IL-6)受体明显增高的事实,根据TNF结构与功能研究的最新信息,利用PCR技术,对人TNFα基因进行了改造,并将其与人IL-6成熟肽编码区cDNA通过人工接头进行融合。融合蛋白在大肠杆菌中表达后,Westernblot分析表明,分子量约为37kD;活性检测结果证实,该融合蛋白兼具有TNF抗肿瘤活性和结合IL-6受体的能力,在高表达IL-6受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性较同样位点突变的TNF高约3倍。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子 白细胞介素-6 突变体 融合蛋白
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人组织型纤溶酶原激活剂表达调控及高效表达的研究——Ⅱ.t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达 被引量:1
6
作者 欧阳 黄培堂 +2 位作者 徐秀英 陈琳 黄翠芬 《中国科学(C辑)》 CSCD 1996年第1期92-96,共5页
曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr^-),经过混... 曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr^-),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000~6000IU/10~6细胞·d^(-1)。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。 展开更多
关键词 组织型 纤溶酶原激活剂 研制 高效表达 基因工程
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t-PA在哺乳动物细胞中的表达调控及高效表达 被引量:1
7
作者 欧阳 顾利群 +1 位作者 黄培堂 黄翠芬 《生物技术通讯》 CAS 1994年第1期45-46,共2页
人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤维蛋白有较强的亲和力,可选择性溶解血栓而不引起全身出血倾向,所以是一种较理想的溶血栓药物。美国的重组t-PA已通过FDA批准,应用于临床,每年销售达数亿美元。国内上医,北大,南大及我所先后开展了t-PA... 人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤维蛋白有较强的亲和力,可选择性溶解血栓而不引起全身出血倾向,所以是一种较理想的溶血栓药物。美国的重组t-PA已通过FDA批准,应用于临床,每年销售达数亿美元。国内上医,北大,南大及我所先后开展了t-PA在CHO细胞中的表达的研究,经多年努力表达水平约1~2μg(200~400IU)/10~6细胞/24小时,但该水平离中试生产尚有差距。 展开更多
关键词 细胞克隆 T-PA 溶血栓药 选择性溶解 上医 体外翻译 翻译起始区 终止密码 外源基因 非翻译区
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当前西方工运面临的挑战及其对策 被引量:2
8
作者 欧阳 《当代世界与社会主义》 CSSCI 北大核心 2003年第4期50-52,共3页
在整个西方经济低迷、政治右倾化的背景下 ,西方工会运动面临着严重失业、会员流失、福利削减等问题。为此 ,西方工会进行了大胆的探索 ,采取了相应的措施 ,也取得了一些积极效果 ,但总体而言 。
关键词 西方工运 挑战 对策
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用三引物法提高PCR的扩增效率及特异性 被引量:1
9
作者 欧阳 黄培堂 黄翠芬 《生物技术通讯》 CAS 1994年第3期137-138,共2页
聚合酶链反应(PCR)现已广泛应用于分子生物学研究的各个领域。对于模板量较低的样品及单拷贝基因,通常通过增加扩增的次数或多次PCR提高扩增的效率,但这样往往出现非特异性反应。本文采用三引物双扩增法大大提高了PCR扩增的效率及特异性... 聚合酶链反应(PCR)现已广泛应用于分子生物学研究的各个领域。对于模板量较低的样品及单拷贝基因,通常通过增加扩增的次数或多次PCR提高扩增的效率,但这样往往出现非特异性反应。本文采用三引物双扩增法大大提高了PCR扩增的效率及特异性。 1 材料与方法 Melanoma细胞由本室保存,能分泌人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)。RT 展开更多
关键词 扩增效率 PCR 特异性 聚合酶链反应 非特异性反应 单拷贝 扩增法 琼脂糖凝胶电泳 碱基互补 变性凝胶电泳
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人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 被引量:1
10
作者 刘丽 欧阳 +1 位作者 黄培堂 刘及 《生物技术通讯》 CAS 1994年第4期159-162,共4页
本文利用PCR技术,对人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因进行了改造,并将其与人白细胞介素-6(hIL-6)成熟肽编码区cDNA进行融合,构建了5′IL-6-TNF△融合蛋白的表达质粒pBVIL6-TNFA△。DNA序列分析证明,PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计序列及... 本文利用PCR技术,对人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因进行了改造,并将其与人白细胞介素-6(hIL-6)成熟肽编码区cDNA进行融合,构建了5′IL-6-TNF△融合蛋白的表达质粒pBVIL6-TNFA△。DNA序列分析证明,PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计序列及相应的cDNA序列完全一致;重组子用限制性内切酶酶切鉴定,含有正确的IL6-TNF△融合cDNA片段;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量约为37kD,与预计的相符合;生物学活性分析初步表明,该融合蛋白具有抗肿瘤活性。 展开更多
关键词 人肿瘤坏死因子 人白细胞介素-6 突变体 融合蛋白
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基因治疗中基因转移技术研究进展 被引量:1
11
作者 欧阳 黄培堂 黄翠芬 《生物技术通讯》 CAS 1995年第2期74-77,共4页
自1990年9月美国首次成功地进行ADA缺乏症的基因治疗以来,基因治疗已成为当前生物医学领域中进展最快的领域之一。迄今为止,已有70余项人体基因治疗计划获美国FDA和重组DNA咨询委员会(RAC)的批准,进入临床试验。基因治疗研究的范围也由... 自1990年9月美国首次成功地进行ADA缺乏症的基因治疗以来,基因治疗已成为当前生物医学领域中进展最快的领域之一。迄今为止,已有70余项人体基因治疗计划获美国FDA和重组DNA咨询委员会(RAC)的批准,进入临床试验。基因治疗研究的范围也由最初的遗传病迅速扩展到肿瘤、心血管疾病。 展开更多
关键词 基因治疗 基因转移技术 病毒载体 重组腺病毒 技术研究 目的基因 外源基因 反转录 转铁蛋白 唾液酸
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组织型纤溶酶原激活剂抗血清的制备及初步应用
12
作者 徐秀英 陈琳 +4 位作者 周卫 刘士辉 欧阳 王珏 黄培堂 《生物技术通讯》 CAS 1995年第4期162-163,共2页
在研究t-PA过程中,区分t-PA与其它纤溶药物的较特异方法是采用抗体中和抑制试验。本文用200μg t-PA经背部皮下多点免疫家兔,待产生的抗体效价经ELISA测定达1∶1000后,经兔动脉放血收集抗血清。该血清有DE-32直接过滤法纯化,检定其纯度... 在研究t-PA过程中,区分t-PA与其它纤溶药物的较特异方法是采用抗体中和抑制试验。本文用200μg t-PA经背部皮下多点免疫家兔,待产生的抗体效价经ELISA测定达1∶1000后,经兔动脉放血收集抗血清。该血清有DE-32直接过滤法纯化,检定其纯度及特异性后,用于中和抑制试验检定t-PA的基因工程产品。结果表明本组构建表达的野生型t-PA和突变体t-PA的活性均能被兔抗t-PA抗体抑制,为特异产品。 展开更多
关键词 组织型纤溶酶原激活剂 抗血清 中和抑制实验
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野生型组织型纤溶酶原激活剂工程细胞株生物学特性分析
13
作者 徐秀英 陈琳 +4 位作者 欧阳 刘士辉 朱恒奇 黄培堂 黄翠芬 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期293-295,共3页
组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是体内丝氨酸类蛋白酶。它能激活纤维蛋白溶酶原生成纤溶酶,后者将不溶性的纤维蛋白降解为可溶性肽段,使血栓溶解,血管再通。而且由于它与纤维蛋白有高亲和力,只激活血栓表面纤溶酶原,溶解局部血... 组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是体内丝氨酸类蛋白酶。它能激活纤维蛋白溶酶原生成纤溶酶,后者将不溶性的纤维蛋白降解为可溶性肽段,使血栓溶解,血管再通。而且由于它与纤维蛋白有高亲和力,只激活血栓表面纤溶酶原,溶解局部血栓,因而引起全身出血倾向小。目前,... 展开更多
关键词 野生型 T-PA 工程细胞株 纤溶酶原激活剂
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野生型组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)工程细胞株生物学特性分析
14
作者 徐秀英 陈琳 +4 位作者 欧阳 刘士辉 朱恒奇 黄培堂 黄翠芬 《生物技术通讯》 CAS 1997年第1期14-16,共3页
野生型t-PA工程细胞4B3形态与亲代细胞CHO-dhfr-相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压达5×10^(-7)mol/L时,少数细胞略变瘦长,但仍显多角形,形态正常。细胞无血清培养上清经FAPA检测,亚克隆株表达水平为10~6细胞4000~5000IU/24h... 野生型t-PA工程细胞4B3形态与亲代细胞CHO-dhfr-相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压达5×10^(-7)mol/L时,少数细胞略变瘦长,但仍显多角形,形态正常。细胞无血清培养上清经FAPA检测,亚克隆株表达水平为10~6细胞4000~5000IU/24h。细胞经体外传代3个月及冻存3个月后复苏,部分亚克隆株表达水平下降,多数仍为10~6细胞4000IU/24h,表明4B3细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的4B3rt-PA均无致瘤性病毒,支原体检查为阴性。遗传特性分析表明,该工程细胞与其亲代细胞CHO-dhfr-细胞染色体数均为20条,均有不同程度不同类型的畸变。该工程细胞的畸变率为16%。CHO-dhfr-细胞畸变率为6%。属正常范围。结果表明4B3细胞株为高效表达的性能优良的工程细胞株。 展开更多
关键词 野生型t-PA 工程细胞株 特性分析
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控
15
作者 欧阳 黄培堂 黄翠芬 《生物技术通讯》 CAS 1994年第2期58-62,共5页
运用反转录-PCR技术,从黑色素瘤细胞中扩增出t—PA cDNA 5′末端460bp的片段,再经重组获得含完整5′-UTR的t—PA cDNA克隆,在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达发现,t—PA mRNA 5′—UTR对其表达有明显的抑制作用。将t—PA mRN... 运用反转录-PCR技术,从黑色素瘤细胞中扩增出t—PA cDNA 5′末端460bp的片段,再经重组获得含完整5′-UTR的t—PA cDNA克隆,在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达发现,t—PA mRNA 5′—UTR对其表达有明显的抑制作用。将t—PA mRNA 5′—UTR用苜蓿病毒RNA 5′—UTR替换,使t—PA的表达水平提高3-7倍,mRNA翻译起始区二级结构分析结果表明,翻译起始区的二级结构与t-PA的表达水平有关。 展开更多
关键词 人组织型纤溶酶原激活剂 非翻译区 表达调控
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吖啶酯发光法分析测定组织型纤溶酶原激活剂的研究 被引量:1
16
作者 徐秀英 刘农乐 +4 位作者 陈琳 王珏 欧阳 蒋滋慧 黄培堂 《生物技术通讯》 CAS 1995年第3期114-117,140,共5页
本文建立了灵敏度高、能定量测活且成本低廉的吖啶酯(AE)发光分析组织型纤维溶酶原激活剂(t-PA)的方法。该法灵敏度达0.125 IU/ml;在t-PA 0.125~8.0IU/ml范围内,t-PA活力单位对数与其发光计数呈良好的线性关系(r=0.997);批内变异系数为... 本文建立了灵敏度高、能定量测活且成本低廉的吖啶酯(AE)发光分析组织型纤维溶酶原激活剂(t-PA)的方法。该法灵敏度达0.125 IU/ml;在t-PA 0.125~8.0IU/ml范围内,t-PA活力单位对数与其发光计数呈良好的线性关系(r=0.997);批内变异系数为8%(n=8);回收率为86~122%。本法用于测定人黑色素瘤细胞mt-PA、CHO细胞表达的rt-PA,获得与纤维蛋白琼脂板测定法(FAPA)相一致的结果;测定健康人静脉闭塞前后血浆中t-PA活性的变化,显示出明显差别,静脉闭塞后血浆中t-PA活性约为静脉闭塞前的2~3倍。该法对肺癌患者血浆t-PA活性测定结果明显高于正常人,因而具有临床诊断价值。 展开更多
关键词 吖啶酯 发光法 组织型纤溶酶原激活剂
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Influence of 5'-untranslated region (UTR) sequence on the regulation of human tissue plasminogen activator (t-PA) mRNA expression
17
作者 欧阳 黄培堂 黄翠芬 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 1995年第16期1378-1383,共6页
Human tissue plasminogen activator (t-PA) is a serine protease that plays a key role infibrinolysis, a process of dissolving blood clot. t-PA is produced by a variety of cells andtissues and many tumor cell lines. It ... Human tissue plasminogen activator (t-PA) is a serine protease that plays a key role infibrinolysis, a process of dissolving blood clot. t-PA is produced by a variety of cells andtissues and many tumor cell lines. It is well known that t-PA expression in these cell 展开更多
关键词 human TISSUE plasminugen ACTIVATOR untranslated REGION REGULATION expression.
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Inhibitory effect of 3'-untranslated region (3'-UTR) of human tissue-plasminogen activator (ht-PA) mRNA on its expression
18
作者 欧阳 黄培堂 黄翠芬 《Science China Chemistry》 SCIE EI CAS 1995年第10期1253-1260,共8页
A series of t-PA cDNA mutants containing different parts of 3’-UTR sequences have beenconstructed.In vitro translation of t-PA transcripts in rabbit reticulocyte lysates and its expression in COS-7cells show that th... A series of t-PA cDNA mutants containing different parts of 3’-UTR sequences have beenconstructed.In vitro translation of t-PA transcripts in rabbit reticulocyte lysates and its expression in COS-7cells show that the 3’-UTR sequence has a very strong inhibitory effect on t-PA translation.The deletion of3’-UTR results in 3—8-fold increase of t-PA expression.Further study shows that an AU-rich sequence of some200 nt at 3’ end of 3’-UTR is responsible for the translational inhibition.RNA stability experiment reveals thatthe AU-rich segment leads to a 3-fold decrease of t-PA mRNA stability.The insertion of this segment into the3’-UTR of luciferase gene results in an obvious inhibition of Luc expression.A model is proposed for theregulation of t-PA expression. 展开更多
关键词 human tissue-plasminogen ACTIVATOR untranslated region regulation of EXPRESSION
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重组人肿瘤坏死因子突变体的构建和表达
19
作者 吴松泉 刘丽 +2 位作者 欧阳 黄培堂 梁植权 《温州医学院学报》 CAS 1996年第3期131-134,共4页
运用PCR技术,对天然人肿瘤坏死因子α(humantumornecrosisfactor一α,TNF)基因进行了改造,去除了天然TNFN端的7个氨基酸,同时以Ary ̄8Lys ̄9Arg10Phe157分别取代了原来的... 运用PCR技术,对天然人肿瘤坏死因子α(humantumornecrosisfactor一α,TNF)基因进行了改造,去除了天然TNFN端的7个氨基酸,同时以Ary ̄8Lys ̄9Arg10Phe157分别取代了原来的ProSerAspLeu,形成新的突变体TNF△。将突变体克隆于表达载体pBV220后,在E.coliDH5α中得到了表达,表达产物的分子量为17KD。表达量为菌体总蛋白量的15%。L929细胞的杀伤活性为2.2×106U/ml,是天然TNF活性的七倍。本工作对研制高效低毒副作用的TNF制剂具有重要意义。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子 突变体 基因 表达 构建 重组
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在哺乳动物细胞中的表达调控及高效表达
20
作者 欧阳 顾利群 +1 位作者 黄培堂 黄翠芬 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 1994年第S1期258-259,共2页
人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在哺乳动物细胞中的表达调控及高效表达军事医学科学院生物工程研究所欧阳应斌,顾利群,黄培堂,黄翠芬人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤维蛋白有较强的亲和力,可选择性溶解血栓而不引起全... 人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在哺乳动物细胞中的表达调控及高效表达军事医学科学院生物工程研究所欧阳应斌,顾利群,黄培堂,黄翠芬人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤维蛋白有较强的亲和力,可选择性溶解血栓而不引起全身出血倾向,所以是一种较理想的溶血... 展开更多
关键词 PA 细胞克隆 外源基因 翻译起始区 选择性溶解 荧光素酶 体外翻译 高度同源 表达质粒 序列同源性
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