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KRAS对T⁃ALL细胞株增殖及凋亡的影响
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作者 柳梓杨 舒逸 +5 位作者 傅国 苏虹宇 朱丹 曾腊梅 马德禹 邹琳 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期1040-1048,共9页
目的:探讨RAS蛋白家族在维持T⁃ALL细胞株体外生长中的功能。方法:纯化T⁃ALL细胞株DNA,利用PCR法扩增3个RAS基因(KRAS、NRAS、HRAS)的编码区。经T⁃A克隆后,Sanger法对KRAS、NRAS、HRAS基因编码区测序。将siRNA克隆到pSEH⁃361载体,在HEK⁃2... 目的:探讨RAS蛋白家族在维持T⁃ALL细胞株体外生长中的功能。方法:纯化T⁃ALL细胞株DNA,利用PCR法扩增3个RAS基因(KRAS、NRAS、HRAS)的编码区。经T⁃A克隆后,Sanger法对KRAS、NRAS、HRAS基因编码区测序。将siRNA克隆到pSEH⁃361载体,在HEK⁃293T细胞中与pAMPHO和pVSVG一起包装成逆转录病毒,随后感染T⁃ALL细胞。qRT⁃PCR和Western blot检测基因表达情况。利用Annexin V⁃PE/7⁃AAD染色T⁃ALL细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况。利用Hoechst 33258染色T⁃ALL细胞,流式细胞术检测细胞周期分布情况。经抗体染色,荧光显微镜观察cleaved⁃Caspase 3蛋白的表达。结果:在T⁃ALL细胞株中,除Loucy和P12⁃ICH细胞KRAS基因发生c.6187G>A(p.KRASG12D)突变,其余RAS基因均未发现错义突变。除PEER细胞(IC_(50)=47.916μmol/L)外,泛RAS抑制剂Compound 3144对其它T⁃ALL细胞均有一定杀伤作用。同样,除PEER细胞(IC_(50)=94.2265μmol/L)外,Tipifarnib可诱导多种T⁃ALL细胞凋亡。抑制KRAS表达后,T⁃ALL细胞凋亡明显,细胞周期阻滞。结论:KRAS蛋白维持T⁃ALL细胞株体外生长,是治疗T⁃ALL的潜在药物靶点。 展开更多
关键词 RAS 急性T淋巴细胞白血病 细胞增殖 细胞凋亡
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应用流式-荧光原位杂交协助鉴别诊断EB病毒感染的淋巴细胞亚群
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作者 苏虹宇 舒逸 +5 位作者 傅国 柳梓杨 朱丹 曾腊梅 马德禹 邹琳 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期897-907,共11页
目的:建立流式细胞术-荧光原位杂交联用技术(Flow-FISH),探讨Flow-FISH技术在临床EB病毒(Epstein-Barr virus)感染性疾病中感染细胞亚型鉴定的临床前诊断价值。方法:通过Ficoll-paque离心分离法收集重庆医科大学附属儿童医院招募的9例EB... 目的:建立流式细胞术-荧光原位杂交联用技术(Flow-FISH),探讨Flow-FISH技术在临床EB病毒(Epstein-Barr virus)感染性疾病中感染细胞亚型鉴定的临床前诊断价值。方法:通过Ficoll-paque离心分离法收集重庆医科大学附属儿童医院招募的9例EBV感染患者的外周血标本中单个核细胞;通过qRT-PCR检测细胞EBER1及EBER2表达;通过荧光标记抗体对细胞表面标志物进行检测,经固定破膜剂对标记后细胞进行固定及破膜处理后与FISH探针37℃条件下过夜杂交,通过流式细胞仪、荧光显微镜检测细胞状态、表面抗原染色以及FISH探针与靶mRNA的结合。结果:优化固定破膜剂配方,建立0.2%Tween-20 4℃破膜15 min为破膜条件,此条件对细胞状态及表面抗原影响小,不干扰流式细胞术对细胞亚群判定。优化杂交液配方,探明20%甲酰胺和7%硫酸葡聚糖在37℃过夜条件下杂交为最优杂交条件,此条件下细胞形态及流式分群好,探针杂交效果佳。通过使用Flow-FISH技术能特异性区分各EBV;以及EBV;淋巴细胞系。通过Flow-FISH技术,成功鉴定临床外周血标本中的EBV;淋巴细胞亚群。结论:初步建立流式细胞术-荧光原位杂交联用检测EBV感染细胞亚群技术,为其进一步的临床前实验奠定基础。 展开更多
关键词 流式-荧光原位杂交 爱泼斯坦-巴尔病毒 鉴别诊断 EB病毒编码的小RNA
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利用胸腺类器官体外诱导小鼠T淋巴细胞分化
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作者 宫茂源 傅国 +6 位作者 舒逸 朱丹 蒋婷婷 王皓飚 柳梓杨 苏虹宇 邹琳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期679-686,共8页
目的体外构建胸腺类器官,模拟胸腺组织三维结构,诱导多种来源小鼠造血干祖细胞(HSPC)向T细胞分化。方法构建表达小鼠Delta样经典缺刻基因配体1(DLL1)及绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒载体;通过逆转录病毒感染OP9小鼠骨髓间充质细胞,构建... 目的体外构建胸腺类器官,模拟胸腺组织三维结构,诱导多种来源小鼠造血干祖细胞(HSPC)向T细胞分化。方法构建表达小鼠Delta样经典缺刻基因配体1(DLL1)及绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒载体;通过逆转录病毒感染OP9小鼠骨髓间充质细胞,构建OP9-DLL1细胞系;实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测OP9-DLL1细胞DLL1的mRNA和蛋白表达,免疫荧光细胞化学染色检测OP9-DLL1细胞DLL1的表达和分布;提取C57BL/6小鼠E13.5胎肝HSPC及骨髓HSPC,分别与OP9-DLL1细胞按适当比例混合后离心压实,置于气-液交面培养;利用荧光显微镜观察胸腺类器官生长,流式细胞术检测T细胞表面CD3、CD4、CD8、CD25、CD44、CD45、CD117、T细胞受体β(TCRβ)表达,免疫荧光组织化学染色观察造血细胞在胸腺类器官的分布。结果成功构建表达小鼠DLL1及GFP的逆转录病毒载体,逆转录病毒感染OP9细胞后,通过GFP筛选获得OP9-DLL1细胞,OP9-DLL1细胞DLL1 mRNA和DLL1蛋白表达明显增加,DLL1蛋白表达于OP9-DLL1细胞膜。诱导培养40 d内,胸腺类器官状态良好且体积逐渐增大。胸腺类器官诱导T细胞程序性分化,HSPC分化为CD3+T细胞。结论通过OP9-DLL1细胞成功构建胸腺类器官,体外诱导多种来源小鼠HSPC向T细胞分化。 展开更多
关键词 T细胞分化 体外 胸腺类器官 缺刻基因1(NOTCH1)
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