为建立检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法,在本实验室前期试验筛选到扩增效果相对最好的3对引物(扩增基因区域对应ORF6)的基础上,本研究以PRRSV CH-1R株cDNA作为模板,利用这3对引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆...为建立检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法,在本实验室前期试验筛选到扩增效果相对最好的3对引物(扩增基因区域对应ORF6)的基础上,本研究以PRRSV CH-1R株cDNA作为模板,利用这3对引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD18-T载体,构建3个重组质粒标准品。采用方阵法对荧光定量PCR反应条件优化,最终建立了3对引物的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。结果显示,标准曲线Ct值均与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R~2)分别为0.992、0.999、0.999;该方法除对美洲型PRRSV有特异性扩增外,对猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、欧洲型PRRSV等病原的基因组DNA或cDNA均无扩增,特异性强;对3种质粒标准品的检测下限均为1.228×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;组内与组间重复性试验变异系数均小于2%,重复性较好。利用该方法检测6份经预检的PRRS临床样品,3对引物的阳性检出率均为100%,与国标荧光定量PCR方法检出率相当,高于常规PCR(50%、50%和83.3%)的阳性检出率。尽管该方法的3对引物和国标方法均能检出,但部分样品不同引物检测的Ct值有差异。本研究通过利用多对引物并提高引物覆盖面,可减少因引物结合位点突变引起的检测不准确问题,3对引物中,若有1对引物检测样品的结果呈阳性,则该样品判为阳性样品,本研究为PRRSV的快速和定量检测提供了思路和方法。展开更多
文摘为建立检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法,在本实验室前期试验筛选到扩增效果相对最好的3对引物(扩增基因区域对应ORF6)的基础上,本研究以PRRSV CH-1R株cDNA作为模板,利用这3对引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD18-T载体,构建3个重组质粒标准品。采用方阵法对荧光定量PCR反应条件优化,最终建立了3对引物的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。结果显示,标准曲线Ct值均与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R~2)分别为0.992、0.999、0.999;该方法除对美洲型PRRSV有特异性扩增外,对猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、欧洲型PRRSV等病原的基因组DNA或cDNA均无扩增,特异性强;对3种质粒标准品的检测下限均为1.228×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;组内与组间重复性试验变异系数均小于2%,重复性较好。利用该方法检测6份经预检的PRRS临床样品,3对引物的阳性检出率均为100%,与国标荧光定量PCR方法检出率相当,高于常规PCR(50%、50%和83.3%)的阳性检出率。尽管该方法的3对引物和国标方法均能检出,但部分样品不同引物检测的Ct值有差异。本研究通过利用多对引物并提高引物覆盖面,可减少因引物结合位点突变引起的检测不准确问题,3对引物中,若有1对引物检测样品的结果呈阳性,则该样品判为阳性样品,本研究为PRRSV的快速和定量检测提供了思路和方法。
