应用rpoB和16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳技术对山羊瘤胃细菌多样性的研究 被引量：22

1

作者 石鹏君 柏映国 +6 位作者 袁铁铮 姚斌 范云六 周志刚 孟昆 伍宁丰 刁其玉 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期285-289,共5页

采用免培养的rpoB和16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)对3种山羊(波尔山羊,内蒙古绒山羊,四川南江黄羊)瘤胃细菌优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示rpoBDGGE图谱中条带数目少于16S rDNA图谱,并且条带分离效果明显,更有... 采用免培养的rpoB和16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)对3种山羊(波尔山羊,内蒙古绒山羊,四川南江黄羊)瘤胃细菌优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示rpoBDGGE图谱中条带数目少于16S rDNA图谱,并且条带分离效果明显,更有利于分析瘤胃细菌群落组成。从两种DGGE图谱中均可以发现3种山羊瘤胃细菌具有一定的相似性,种内个体间相似性明显高于种间相似性,这说明寄主品种是影响瘤胃细菌种群构成的一个重要因素。同时进行了部分优势细菌16S rDNA基因V6-V8区序列的系统发育分析。基因序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有4条克隆的序列与基因库最相似菌的相似性大于97%,余下的克隆序列相似性在89%～96%之间,其中13条序列的与之相似性最高的序列均来自于未被鉴定的瘤胃细菌。 展开更多

关键词 DGGE 16S RDNA基因 编码RNA聚合酶β亚基(rpoB)基因 瘤胃细菌 遗传多样性

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通过N端替换提高木聚糖酶的热稳定性 被引量：13

2

作者 杨浩萌 孟昆 +5 位作者 罗会颖 王亚茹 袁铁铮 柏映国 姚斌 范云六 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期26-32,共7页

以来源于Thermomonospora fusca的耐高温木聚糖酶TfxA和来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB为亲本,构建出耐热高比活融合木聚糖酶TB,将TB在大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达并对表达产物的酶学性质进行分析... 以来源于Thermomonospora fusca的耐高温木聚糖酶TfxA和来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB为亲本,构建出耐热高比活融合木聚糖酶TB,将TB在大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达并对表达产物的酶学性质进行分析比较。分析表明,融合蛋白TB最适pH值为6.0,最适温度为70℃,较XYNB有大幅度的提高;在热稳定性方面,TB明显优于XYNB,将两种稀释好的酶液分别在80℃和90℃下热处理3min,TB的热稳定性较XYNB提高了6倍左右;TB的pH稳定性为5～9(相对剩余活性在50%以上的pH范围),较XYNB有所下降,但两者的比活性基本不变,保持了亲本XYNB的高比活性。通过同源建模和序列比较,分析了可能影响融合蛋白TB酶学性质的因素,为进一步研究木聚糖酶的结构与功能提供了新的思路。 展开更多

关键词 融合木聚糖酶 木聚糖酶氮端 热稳定性

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Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶摇瓶发酵条件的优化 被引量：14

3

作者 柏映国 燕国梁 +1 位作者 堵国成 陈坚 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期27-32,共6页

介绍了吸水链霉菌 (Streptomyceshygroscopicus)WSH0 3 -1 3的筛选过程 ,重点考察了在摇瓶条件下 ,不同碳、氮源对吸水链霉菌生长和产酶的影响 ,利用正交实验 ,确定了复合碳、氮源的浓度 ,并对种龄、接种量、初始 pH值、培养温度和培养... 介绍了吸水链霉菌 (Streptomyceshygroscopicus)WSH0 3 -1 3的筛选过程 ,重点考察了在摇瓶条件下 ,不同碳、氮源对吸水链霉菌生长和产酶的影响 ,利用正交实验 ,确定了复合碳、氮源的浓度 ,并对种龄、接种量、初始 pH值、培养温度和培养时间等条件进行了研究。通过对发酵过程的优化 ,酶活达到 4 46u/mL ,比初始条件下提高了 3 0 9倍。 展开更多

关键词 菌种筛选 微生物谷氨酰胺转胺酶 优化 分批发酵 STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS

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增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量 被引量：12

4

作者 罗会颖 黄火清 +5 位作者 柏映国 王亚茹 杨培龙 孟昆 袁铁铮 姚斌 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期528-533,共6页

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-... 为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。 展开更多

关键词 植酸酶 载体改造 拷贝数增加 高效表达

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甜菜糖蜜发酵饲料对肉羊生长、屠宰性能、肉品质以及表观消化率的作用 被引量：17

5

作者 成思源 马涛 +5 位作者 杨东 王文义 柏映国 马书林 马友记 刁其玉 《饲料工业》 CAS 北大核心 2022年第19期7-13,共7页

试验将甜菜糖蜜发酵饲料按不同比例添加在肉羊饲粮中,旨在研究其对肉羊生长性能、屠宰性能、肉品质以及表观消化率的作用。选取体重为(21.0±0.2)kg的寒杂羊公羔54只,随机分为3组,每组3个重复,每个重复6只羊。分别添加0、10、50 kg/... 试验将甜菜糖蜜发酵饲料按不同比例添加在肉羊饲粮中,旨在研究其对肉羊生长性能、屠宰性能、肉品质以及表观消化率的作用。选取体重为(21.0±0.2)kg的寒杂羊公羔54只,随机分为3组,每组3个重复,每个重复6只羊。分别添加0、10、50 kg/t甜菜糖蜜发酵饲料(对照组、FⅠ组、FⅡ组)。试验共计100 d,预试期10 d,正试期90 d,每30 d进行一次称重,正试期第70天到第80天进行消化代谢试验,正试期结束后,每组选取8只羊屠宰并采样,测定屠宰性能与肉品质指标。结果显示:①各组生长性能无显著差异(P>0.05),但FⅡ组的平均日增重较对照组提高,而采食量低于对照组,饲粮转化率较对照组有所改善。②各试验组胴体重、胴体脂肪含量值无显著差异(P>0.05),FⅡ组肉羊屠宰率、眼肌面积显著高于对照组(P<0.05)。③各组肉品质指标无显著差异(P>0.05)。④FⅡ组粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维以及酸性洗涤纤维的消化率显著高于对照组(P<0.05),各组干物质、代谢能的表观消化率无显著差异(P>0.05)。综上所述,试验采用的发酵饲料可以明显提高饲粮粗蛋白、粗脂肪、酸性洗涤纤维以及中性洗涤纤维的表观消化率,对肉羊的平均日增重有促进作用,能显著提高肉羊的屠宰率,每吨添加50 kg发酵饲料的作用较优。 展开更多

关键词 肉羊 酿酒酵母 甜菜糖蜜发酵饲料 生长性能 屠宰性能 肉品质 表观消化率

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木聚糖酶XYNB的N46D突变、表达及酶学性质变化 被引量：12

6

作者 杨浩萌 柏映国 +5 位作者 李江 罗会颖 王亚茹 伍宁丰 范云六 姚斌 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期204-211,共8页

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.... 对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.将突变酶XYNBN46D在毕赤酵母中表达,表达的XYNBN46D经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNBN46D的最适pH值由5·2下降到4·2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,热稳定性和最适温度也有一定的提高,但酶的比活性显著下降.结果证实,木聚糖酶XYNB的第46位Asn与其最适pH值相关.对导致酶学性质改变的可能因素进行了分析,结果为进一步的结构与功能研究提供了资料. 展开更多

关键词 木聚糖酶 XYNBN46D 定点突变 pH特性

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木聚糖酶XYNB分子中折叠股B1和B2间的疏水作用对酶热稳定性的影响 被引量：10

7

作者 杨浩萌 姚斌 +6 位作者 罗会颖 张王照 王亚茹 袁铁铮 柏映国 伍宁丰 范云六 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期414-419,共6页

对来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模,并结合嗜热木聚糖酶氮末端芳香族氨基酸疏水作用的结构分析,设计了XYNB的T11Y定点突变,观察XYNB分子中折叠股B1和B2的疏水作用对酶的热稳定性的影响。将突变酶XYN... 对来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模,并结合嗜热木聚糖酶氮末端芳香族氨基酸疏水作用的结构分析,设计了XYNB的T11Y定点突变,观察XYNB分子中折叠股B1和B2的疏水作用对酶的热稳定性的影响。将突变酶XYNB′在毕赤酵母中表达,表达的XYNB′经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNB′的耐热性比XYNB有明显的提高,但最适温度与原酶一样为6 0℃。另外,XYNB′的最适pH、Km值及比活性均有一定的改变。实验证实了木聚糖酶XYNB的氮端芳香族氨基酸之间的疏水相互作用与其热稳定性相关,为进一步的结构与功能研究提供了优良的基因材料。 展开更多

关键词 木聚糖酶XYNB 定点突变 热稳定性

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复合酶制剂对肉羊生长性能、屠宰性能、肉品质以及消化代谢的影响 被引量：11

8

作者 成思源 马涛 +4 位作者 杨东 王文义 柏映国 马友记 刁其玉 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期4530-4539,共10页

本试验旨在研究饲粮中添加不同剂量复合酶制剂对肉羊生长性能、屠宰性能、肉品质和消化代谢的影响。选取体重在(21.0±0.2)kg的寒杂羊公羔72只,随机分为4组,每组3个重复,每个重复6只。4组羔羊分别饲喂在基础饲粮中添加0(对照组)、0.... 本试验旨在研究饲粮中添加不同剂量复合酶制剂对肉羊生长性能、屠宰性能、肉品质和消化代谢的影响。选取体重在(21.0±0.2)kg的寒杂羊公羔72只,随机分为4组,每组3个重复,每个重复6只。4组羔羊分别饲喂在基础饲粮中添加0(对照组)、0.5(M1组)、1.0(M2组)和2.0 kg/t(M3组)复合酶制剂(蛋白酶∶脂肪酶∶淀粉酶=1∶1∶1)的试验饲粮。预试期10 d,正试期90 d。每天记录1次采食量,每隔30 d进行1次称重;正试期第70~80天采用全收粪尿法进行消化代谢试验;正试期结束后,每组选取8只羊进行屠宰,测定其屠宰性能、肉品质指标。结果显示:1)各组全期平均日增重、干物质采食量和料重比差异不显著(P>0.05)。2)M3组胴体重显著高于M1组、M2组和对照组(P<0.05),其他屠宰性能指标各组间无显著差异(P>0.05)。3)各组背最长肌肉色、滴水损失以及pH0 h、ΔpH无显著差异(P>0.05);M2组和M3组羊只背最长肌的pH24 h显著高于对照组(P<0.05)。4)各试验组粗脂肪表观消化率显著高于对照组(P<0.05);M2组和M3组的粗蛋白质表观消化率显著高于对照组(P<0.05);代谢能以及中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙、磷表观消化率各组间差异不显著(P>0.05)。综上所述,本试验条件下,在肉羊生长育肥饲粮中添加2.0 kg/t的复合酶制剂(蛋白酶∶脂肪酶∶淀粉酶=1∶1∶1)可改善肉羊的屠宰性能、肉品质以及养分表观消化率。 展开更多

关键词 肉羊 复合酶制剂 生长性能 屠宰性能 肉品质 养分表观消化率

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一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质 被引量：9

9

作者 密士军 柏映国 +6 位作者 孟昆 王亚茹 姚斌 史秀云 黄火清 张宇宏 石鹏君 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期156-160,共5页

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此... 从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag+的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag+的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。 展开更多

关键词 丝状真菌 青霉 Α-半乳糖苷酶 纯化 酶学性质

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一种高温酸性α-淀粉酶基因的高效表达和表达产物分析 被引量：6

10

作者 袁铁铮 姚斌 +4 位作者 罗会颖 王亚茹 柏映国 伍宁丰 范云六 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期63-68,共6页

一种高温酸性α-淀粉酶基因经密码子优化后在巴斯德毕赤酵母中得到了高效表达,表达的重组α-淀粉酶rBD5063具有α-淀粉酶的活性,表达量达到60mg/L.对rBD5063进行了纯化并对多组分的表达产物进行了研究.rBD5063作用最适pH值为5.0,在pH3.5... 一种高温酸性α-淀粉酶基因经密码子优化后在巴斯德毕赤酵母中得到了高效表达,表达的重组α-淀粉酶rBD5063具有α-淀粉酶的活性,表达量达到60mg/L.对rBD5063进行了纯化并对多组分的表达产物进行了研究.rBD5063作用最适pH值为5.0,在pH3.5～10.0范围内酶活性保留50%以上,最适温度在105～110℃之间,在90℃下酶活性半衰期约30min.低浓度Ca2+对激活rBD5063活性和维持稳定性是必需的,高浓度对活性会产生轻微抑制作用,Mg2+、SDS和Trition X-100都能够部分抑制rBD5063活性,Cu2+和EDTA严重抑制rBD5063活性.表达产物水解可溶性淀粉主要产物是单糖和低聚寡糖.表达产物包括分子量分别是62、56、44kD的3种活性组分,在通常情况下主要以大分子量活性多聚体的形式存在.重组α-淀粉酶rBD5063不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象,O-连接对rBD5063的热稳定性和最适温度没有显著影响. 展开更多

关键词 高温酸性α-淀粉酶 巴斯德毕赤酵母 基因表达 多组分表达产物

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来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达 被引量：4

11

作者 黄火清 罗会颖 +5 位作者 柏映国 王亚茹 姚斌 孟昆 袁铁铮 杨培龙 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期945-950,共6页

柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框... 柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。通过PCR验证,AppA(m)已整合在酵母染色体上。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到3·2mg/mL发酵液,发酵效价达到每毫升发酵液1·4×107IU以上,高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。 展开更多

关键词 高比活植酸酶 基因改造 毕赤酵母 高效表达

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弗氏柠檬酸杆菌植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究 被引量：4

12

作者 罗会颖 石鹏君 +5 位作者 李江 王亚茹 姚斌 黄火青 袁铁铮 柏映国 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期139-142,共4页

从弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）中分离纯化了一种植酸酶并进行了酶学性质研究，其反应最适pH为4．0．4．5，最适温度为40℃，在37℃下以植酸钠为底物的Km值为0．85nmol/L，Vmax为0．53IU／（mg·min），具有较好的抗胰... 从弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）中分离纯化了一种植酸酶并进行了酶学性质研究，其反应最适pH为4．0．4．5，最适温度为40℃，在37℃下以植酸钠为底物的Km值为0．85nmol/L，Vmax为0．53IU／（mg·min），具有较好的抗胰蛋白酶的能力。酶蛋白的分子量大小约为45kDa，成熟酶蛋白N端序列为QCAPEGYQLQQVLMM。 展开更多

关键词 弗氏柠檬酸杆菌 植酸酶 酶学性质

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谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究概述 被引量：6

13

作者 孙磊 王苑 +3 位作者 柏映国 罗会颖 姚斌 涂涛 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期2236-2244,共9页

谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate,PLP)依赖性酶,广泛存在于自然界的动植物和微生物中,在酸性环境下发生结构变化,不可逆地催化L-谷氨酸或谷氨酸盐α-脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminob... 谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate,PLP)依赖性酶,广泛存在于自然界的动植物和微生物中,在酸性环境下发生结构变化,不可逆地催化L-谷氨酸或谷氨酸盐α-脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。γ-氨基丁酸在人体中作为一种抑制性神经递质,具有重要的生理功能,可以被广泛应用于食品和制药工业中。本文就谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究进展进行概述。 展开更多

关键词 谷氨酸脱羧酶 Γ-氨基丁酸 催化机制 晶体结构

原文传递

发酵法生产谷氨酰胺转胺酶(MTG)的中试研究 被引量：2

14

作者 柏映国 燕国梁 +1 位作者 堵国成 陈坚 《工业微生物》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期1-5,共5页

比较了摇瓶和 2 .5L种子罐所培养的种子液 ,并在 5L罐上考察了以种子罐培养种子时不同接种量对发酵过程的影响。在将 5L小罐实验结果放大到 30 0L和 3m3 罐的中试规模时 ,分别采用以vvm相等和KLa相等的原则 ,对通风量进行放大 ,以P V相... 比较了摇瓶和 2 .5L种子罐所培养的种子液 ,并在 5L罐上考察了以种子罐培养种子时不同接种量对发酵过程的影响。在将 5L小罐实验结果放大到 30 0L和 3m3 罐的中试规模时 ,分别采用以vvm相等和KLa相等的原则 ,对通风量进行放大 ,以P V相等为依据对搅拌转速进行放大。结果表明 ,当采用种子罐培养种子液时 ,适宜的种龄为 18～ 2 0h ,接种量为 2 % ,30 0L罐中酶活和生产强度分别达到 3.12u mL和 78.0u L·h ,均高于 5L罐的水平 ,3m3 罐酶活为 2 .70u mL ,接近于 5L罐的酶活水平 ,表明本研究所采用的通气量。 展开更多

关键词 茂原链轮丝菌 微生物谷氨酰胺转胺酶 MTG 中试 发酵

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一种谷氨酸棒杆菌4-异丙基苯甲酸诱导型启动子的设计与应用

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作者 毋舒宁 苏永平 +3 位作者 李冬雪 柏映国 刘波 张志伟 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期108-116,共9页

【目的】谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业微生物,挖掘可调控性元件可有效拓展谷氨酸棒杆菌研究和应用的广度和深度。【方法】在谷氨酸棒杆菌组成型强启动子P_(H10)上嵌入阻遏蛋白CymR结合的操纵序列CuO,构建了4-异丙基苯甲酸(Cumate)为诱... 【目的】谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业微生物,挖掘可调控性元件可有效拓展谷氨酸棒杆菌研究和应用的广度和深度。【方法】在谷氨酸棒杆菌组成型强启动子P_(H10)上嵌入阻遏蛋白CymR结合的操纵序列CuO,构建了4-异丙基苯甲酸(Cumate)为诱导剂的启动子P_(H10-CuO)。【结果】绿色荧光蛋白作为报告基因的实验结果显示,无诱导剂时,谷氨酸棒杆菌工程菌相对荧光强度较低;以25μg/mL 4-异丙基苯甲酸诱导12 h时,谷氨酸棒杆菌工程菌荧光强度达62000,证明P_(H10-CuO)具有很好的严谨性和诱导表达强度。构建了以启动子P_(H10-CuO)调控recET和Cas12a表达的谷氨酸棒杆菌基因编辑质粒,实现谷氨酸棒杆菌染色体上靶标基因的精准编辑和外源基因插入。【结论】诱导型启动子P_(H10-CuO)具有表达强度高且渗漏表达低的特点,可用于谷氨酸棒杆菌中被其调控基因的时序性表达。 展开更多

关键词 谷氨酸棒杆菌 诱导型启动子 阻遏蛋白CymR 4-异丙基苯甲酸

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在烟草中表达的高比活性木聚糖酶XYNB 被引量：2

16

作者 杨培龙 姚斌 +4 位作者 王亚茹 罗会颖 袁铁铮 柏映国 范云六 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期176-181,共6页

来源于橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)A1的木聚糖酶XYNB是一性质优良的高比活性木聚糖酶,已在饲料中作为添加剂应用。本研究利用携带双35S启动子和AMV增强子的表达载体,在烟草中高效表达了XYNB。转基因烟草及其子代植株基... 来源于橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)A1的木聚糖酶XYNB是一性质优良的高比活性木聚糖酶,已在饲料中作为添加剂应用。本研究利用携带双35S启动子和AMV增强子的表达载体,在烟草中高效表达了XYNB。转基因烟草及其子代植株基因组PCR检测证实xynB基因已整合到转基因烟草的基因组中,ELISA和SDS-PAGE以及Westernblot分析确证了xynB基因的高效表达,木聚糖酶活性分析证实了表达酶具有正常的生物学活性。表达的XYNB约占叶片总蛋白含量的6%,转基因烟草表现的最高酶活性约为170 IU/g鲜叶片(23 IU/mg总蛋白)。表达酶蛋白分子量为20.8 kD,与理论分子量相当。转基因植株可以正常生长和繁殖,T1子代植株表现了与亲代相似的酶活性,具有较好的遗传稳定性。 展开更多

关键词 高比活性木聚糖酶 转基因植物 烟草

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高比活木聚糖酶XYN-W及其突变体在酵母中的高效表达 被引量：3

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作者 罗建杰 王亚茹 +5 位作者 袁铁铮 柏映国 黄火清 罗会颖 姚斌 范云六 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 2010年第5期80-85,共6页

将来源于瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的高比活木聚糖酶基因xyn-w整合到毕赤酵母表达载体pPIC9上,通过电击转化得到重组转化子。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,木聚糖酶基因xyn-w得到了高效分泌表达,在5 L发酵罐中木聚糖酶蛋... 将来源于瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的高比活木聚糖酶基因xyn-w整合到毕赤酵母表达载体pPIC9上,通过电击转化得到重组转化子。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,木聚糖酶基因xyn-w得到了高效分泌表达,在5 L发酵罐中木聚糖酶蛋白表达量达到1 mg/mL,酶活性达到13 000 IU以上。XYN-W的C端57个氨基酸序列为连接序列和锚定区域,利用PCR方法将此段序列去除,得到截短的木聚糖酶序列xyn-m。用相同方法构建高效表达XYN-M蛋白的毕赤酵母工程菌株,表达产物经纯化后进行酶学性质测定,结果表明,其比活为19 856.6 IU/mg,Kcat值为4 433.8 s-1,与纯化的XYN-W蛋白(比活性13 795.3 IU/mg、Kcat值2 717.1 s-1)相比,分别提高了43.9%和63.2%。 展开更多

关键词 木聚糖酶 毕赤酵母 XYN-W 高效表达 比活性改良

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产肌醇毕赤酵母细胞工厂的优化

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作者 朱宏宇 王晓璐 +3 位作者 刘亚君 涂涛 柏映国 张杰 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3731-3746,共16页

【背景】肌醇是一种B族维生素,广泛应用于食品、医药、饲料等领域。微生物发酵法是最具前景的肌醇生产方法,但使用大肠杆菌生产的肌醇在食品及医药领域中的使用受到限制。毕赤酵母作为生物安全菌株是工业上生产异源蛋白的良好宿主,其本... 【背景】肌醇是一种B族维生素,广泛应用于食品、医药、饲料等领域。微生物发酵法是最具前景的肌醇生产方法,但使用大肠杆菌生产的肌醇在食品及医药领域中的使用受到限制。毕赤酵母作为生物安全菌株是工业上生产异源蛋白的良好宿主,其本身含有天然的肌醇合成途径,具有被改造成为高效生产肌醇细胞工厂的潜力。【目的】通过代谢工程改造毕赤酵母工程菌株,降低副产物的生成并提高肌醇的产量。【方法】以实验室前期构建的产肌醇毕赤酵母工程菌株为出发菌株,确定副产物阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成相关基因。通过关键基因敲除、发酵液中葡萄糖浓度控制降低副产物的产量。通过过表达甘油转运蛋白、甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶基因实现产肌醇毕赤酵母对甘油和葡萄糖的共利用,得到重组菌Z10。经过发酵条件优化,进一步提高Z10的肌醇产量。【结果】在最优条件下,重组菌Z10的肌醇产量达到36.7 g/L,是目前酵母类细胞工厂生产肌醇的最高值,副产物总产量与出发菌株相比降低了63.1%。【结论】在毕赤酵母中建立了降低阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成的有效策略,并通过甘油、葡萄糖共利用及相对应的发酵条件优化提高了肌醇产量,为肌醇及其他高价值生物活性物质在毕赤酵母中的高效生产提供了重要参考。 展开更多

关键词 肌醇 毕赤酵母 细胞工厂 代谢工程 高密度发酵

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毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能 被引量：2

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作者 李新新 柏映国 +4 位作者 华晨 马锐 石鹏君 罗会颖 姚斌 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期37-47,共11页

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比... 【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。 展开更多

关键词 嗜热蓝状菌 Β-葡萄糖苷酶 N-糖基化 热稳定性 催化效率

原文传递

来源于Alicyclobacillus sp.A4葡萄糖异构酶的克隆表达及转化应用研究 被引量：2

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作者 戴晨霞 曹慧方 +3 位作者 罗会颖 姚斌 柏映国 徐波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期144-151,共8页

葡萄糖异构酶在体外可以将D-葡萄糖异构化为D-果糖,是商业制备高果糖浆的关键酶。本研究从嗜热菌Alicyclobacillus sp.A4中克隆了葡萄糖异构酶(A4GI)基因,并在大肠杆菌BL21中成功进行了表达。利用His-tag蛋白纯化磁珠对粗酶液进行纯化,... 葡萄糖异构酶在体外可以将D-葡萄糖异构化为D-果糖,是商业制备高果糖浆的关键酶。本研究从嗜热菌Alicyclobacillus sp.A4中克隆了葡萄糖异构酶(A4GI)基因,并在大肠杆菌BL21中成功进行了表达。利用His-tag蛋白纯化磁珠对粗酶液进行纯化,并对已纯化的重组A4GI进行详细的酶学性质及转化率的测定。结果表明:A4GI的最适温度和pH分别为65℃和p H 7.5,该酶在p H 6.0-11.0之间很稳定,在pH 6.0-11.0缓冲液中37℃处理1 h后,剩余酶活99%以上。最适反应条件下,重组酶对D-葡萄糖的Km与Vmax值为99.8 mM与3.75μmol/min/mg。在不同浓度的葡萄糖转化实验中,A4GI的转化率在一定底物浓度范围内随底物浓度增加呈现升高的趋势,在底物葡萄糖浓度为3 M时达到52.7%的最高转化率,因此可以实现在高浓度葡萄糖下进行高效转化,降低后期浓缩的生产成本,具有较好的工业应用潜力。 展开更多

关键词 葡萄糖异构酶 高果糖浆 转化率 ALICYCLOBACILLUS sp.A4

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