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19F型肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白P64K结合物的制备及免疫原性 被引量：4
1
作者 周觉非 姚静 +8 位作者 尹丹丹 陈思 杨溢尧 代洁 张珂 饶海林 李春阳 江山 张雪梅 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1131-1134,1185,共5页
目的:采用改良胺化还原法,重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白(rP64K)作为载体蛋白,制备19F型肺炎球菌荚膜多糖(PN19F)结合物。方法:在胺化还原法的基础上,以1,6-己二酰肼(ADH)为分子臂,在碳二亚胺(EDAC)作用下衍化rP64K,蛋白衍化后再与多糖上... 目的:采用改良胺化还原法,重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白(rP64K)作为载体蛋白,制备19F型肺炎球菌荚膜多糖(PN19F)结合物。方法:在胺化还原法的基础上,以1,6-己二酰肼(ADH)为分子臂,在碳二亚胺(EDAC)作用下衍化rP64K,蛋白衍化后再与多糖上的醛基反应,形成共轭结合。采用HPLC、电泳、免疫印迹等方法分析结合物,并将获得的结合物免疫NIH小鼠,用ELISA方法检测多糖IgG水平。结果:电泳和免疫印迹证明了结合物制备成功。动物免疫产生了高滴度的抗PN19F的抗体,并有免疫记忆发生。结论:新的结合方法和新的载体蛋白能有效提高结合效率,以本工艺制备PN19F蛋白结合疫苗是可行的。 展开更多
关键词 19F型肺炎球菌荚膜多糖 重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白 结合疫苗 改良胺化还原法 免疫原性
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疫苗用氢氧化铝佐剂质量标准的初步建立 被引量：4
2
作者 肖詹蓉 张娜 +7 位作者 潘殊男 杨溢尧 艾绪露 李彦涵 许文婷 孙宏亮 吴永林 杨明 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第7期721-725,731,共6页
目的建立疫苗用氢氧化铝佐剂的质量标准。方法参照《欧洲药典》8.0和《中国药典》四部(2015版),选择5个实验室对6个厂家12批氢氧化铝佐剂样品同时进行17个理化项目的检测及分析,建立适合国内氢氧化铝佐剂的质量标准。结果初步建立了疫... 目的建立疫苗用氢氧化铝佐剂的质量标准。方法参照《欧洲药典》8.0和《中国药典》四部(2015版),选择5个实验室对6个厂家12批氢氧化铝佐剂样品同时进行17个理化项目的检测及分析,建立适合国内氢氧化铝佐剂的质量标准。结果初步建立了疫苗用氢氧化铝佐剂17项质量标准。经5个实验室检测,12批样品外观、溶解性能、鉴别试验、无菌、吸附率、硫酸盐含量、硝酸盐含量、铵盐含量、砷盐含量、铁盐含量、重金属含量、氯化钠含量、氯化物含量及细菌内毒素的结果均符合《欧洲药典》8. 0和《中国药典》四部(2015版)相关质量标准;而p H值、铝含量、沉降率检测结果不同厂家之间差异较大。结论建立了适合国内氢氧化铝佐剂的质量评价体系,为氢氧化铝佐剂的质量标准进入2015版《中国药典》增补版提供了方法细则和标准制定依据。 展开更多
关键词 疫苗 氢氧化铝 佐剂 质量标准
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5型肺炎链球菌荚膜多糖与破伤风类毒素的结合及其影响因素探讨 被引量：3
3
作者 尹丹丹 周觉非 +7 位作者 刘威 邹莎莎 杨溢尧 马诚 崔长法 江山 张雪梅 葛永红 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第16期1895-1900,共6页
目的:制备5型肺炎链球菌多糖与破伤风类毒素衍化物的结合物,探讨结合过程中多糖分子大小、多糖蛋白投入比、反应时间等因素对结合终产物的影响。方法:应用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸酯(CDAP)活化剪切后的5型肺炎球菌荚膜多糖,在缩... 目的:制备5型肺炎链球菌多糖与破伤风类毒素衍化物的结合物,探讨结合过程中多糖分子大小、多糖蛋白投入比、反应时间等因素对结合终产物的影响。方法:应用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸酯(CDAP)活化剪切后的5型肺炎球菌荚膜多糖,在缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)作用下与连接了二酰乙二腈(ADH)的破伤风类毒素(TT)进行偶联反应,经分子筛层析纯化,得到5型肺炎链球菌多糖与破伤风类毒素的结合物,并检测其生化指标,免疫原性等。结果:剪切后的多糖免疫原性良好,其与TT的结合物在分子筛上可以很好分离;描述了多糖活化时CDAP的投入量,蛋白与多糖投入比,反应时间等对结合效率、结合物分子量、游离糖含量和结合物的多糖蛋白比影响。合成的结合物在免疫小鼠后,多糖特异性IgG抗体几何平均滴度(GMT)较多糖显著提高,显示免疫增强效应。结论:CDAP方法可以应用于PN5型肺炎链球菌荚膜多糖与破伤风类毒素结合疫苗的制备。 展开更多
关键词 肺炎链球菌 荚膜多糖 结合疫苗 破伤风类毒素
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疫苗制品氢氧化铝佐剂质量控制及国家标准建立 被引量：3
4
作者 马环 肖詹蓉 +6 位作者 杨溢尧 艾绪露 孙宏亮 王晓娟 潘海龙 孟丽 吴永林 《中国药品标准》 CAS 2022年第3期277-280,共4页
目的:建立国内疫苗用氢氧化铝佐剂的质量标准。方法:分别以不同厂家制备工艺获得的氢氧化铝佐剂作为研究对象,参照欧洲药典的铝佐剂质量标准进行氢氧化铝佐剂的检定项目确认、分析方法建立及限度确认,并依据检定结果及产品特性建立国家... 目的:建立国内疫苗用氢氧化铝佐剂的质量标准。方法:分别以不同厂家制备工艺获得的氢氧化铝佐剂作为研究对象,参照欧洲药典的铝佐剂质量标准进行氢氧化铝佐剂的检定项目确认、分析方法建立及限度确认,并依据检定结果及产品特性建立国家标准。结果与结论:建立氢氧化铝佐剂的16项质量控制项目,包括外观、溶解性能、鉴别试验、无菌检查等,并确立了国家标准。目前已建立疫苗用氢氧化铝佐剂的质量标准接近国际标准,可实现对铝佐剂严格的质量控制,进一步提高我国铝佐剂疫苗的安全性和有效性。 展开更多
关键词 氢氧化铝佐剂 检定项目 分析方法 检定限度 质量标准
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b型流感嗜血杆菌多糖竞争ELISA检测方法的建立与应用 被引量：2
5
作者 刘威 江山 +3 位作者 杨溢尧 李小波 兰芳 崔长法 《国际生物制品学杂志》 CAS 2014年第3期118-121,共4页
目的建立检测b型流感嗜血杆菌（Haemophilus in fluenzae typeb，Hib）多聚核糖基核糖醇磷酸盐（polyrmosylribitol phosphate，PRP）的竞争酶联免疫吸附法（competative enzyme-linked immunosorbent assay，cELIsA）。方法以HibPRP-... 目的建立检测b型流感嗜血杆菌（Haemophilus in fluenzae typeb，Hib）多聚核糖基核糖醇磷酸盐（polyrmosylribitol phosphate，PRP）的竞争酶联免疫吸附法（competative enzyme-linked immunosorbent assay，cELIsA）。方法以HibPRP-酪胺（PRP-Ty）为包被抗原，待测PRP为竞争抗原，利用方阵滴定法确定抗原与血清抗PRP抗体的最适反应条件，建立cELISA法并验证其准确性和精密度，并将该法与传统检测法进行比较。结果最适包被PRP-Ty浓度为1．30mg／L，血清抗PRP抗体稀释度为1：40000。该法的检测线性范围为6．25-100．00mg／L，决定系数（R^2）为0．99，批内精密度为3．39％～6．53％，批间精密度为8．48％。该法对HibPRP的检测结果与传统化学法一致。结论建立的Hib多糖cELISA法的准确性和精密性良好，可特异性检测HibPRP。 展开更多
关键词 嗜血菌 流感 b型 多糖类 细菌 酶联免疫吸附测定
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CWPS竞争ELISA检测方法的建立 被引量：2
6
作者 廖红梅 刘威 +3 位作者 杨溢尧 邹莎莎 曾华英 江山 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第21期2492-2495,共4页
目的：建立竞争酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定C-多糖（Cell Wall Polysaccharides，cwes）浓度的方法。方法：以C-多糖为包被抗原，待测多糖为竞争抗原，与优化的抗C-多糖抗体反应，建立标准曲线，... 目的：建立竞争酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定C-多糖（Cell Wall Polysaccharides，cwes）浓度的方法。方法：以C-多糖为包被抗原，待测多糖为竞争抗原，与优化的抗C-多糖抗体反应，建立标准曲线，并验证该方法的准确性和精密度。结果：优化后的C-多糖包被浓度为10μg·mL^-1，抗C-多糖血清稀释度为1：160000。检测线性范围1250～20 ng·mL^-1，最低检测限为10ng·mL^-1，回归方程为B／B0=-0.2521 lg[CWPS]＋0.9529，线性相关系数为R^2=0.99。批内和批间精密度分别为9.7％和6.9％，测定PS6A精糖中标准CWPS的回收率为100.3％。结论：本研究建立的竞争ELISA方法，准确性和精密度均较好，可以检测肺炎链球菌荚膜多糖中CWPS的浓度。 展开更多
关键词 CWPS 肺炎球菌 免疫学检测法 竞争ELISA
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不同链长6A型肺炎球菌荚膜多糖与多糖结合物的稳定性及小鼠免疫原性
7
作者 周觉非 代洁 +9 位作者 张玉洁 蓝天 杜游 赵嘉祯 陈思 邓前 廖红梅 邹莎莎 杨溢尧 葛永红 《国际生物制品学杂志》 CAS 2023年第3期127-133,共7页
目的研究不同链长的6A型肺炎球菌荚膜多糖(type 6A pneumococcal capsular poly-saccharide,Pn6A)稳定性差异及链长对结合物稳定性和免疫原性的影响.方法采用高压均质机获得不同链长的Pn6A,并在1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐作用下... 目的研究不同链长的6A型肺炎球菌荚膜多糖(type 6A pneumococcal capsular poly-saccharide,Pn6A)稳定性差异及链长对结合物稳定性和免疫原性的影响.方法采用高压均质机获得不同链长的Pn6A,并在1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐作用下与破伤风类毒素-己二酰肼衍生物形成共轭结合物.通过比较原始多糖、多糖降解物及结合物的核磁共振氢谱验证结构的正确性,通过硫酸蒽酮法和速率比浊法定量比较抗原性;通过高效液相-分子尺寸排阻层析-多角度激光散射仪比较不同链长多糖的稳定性;分析结合物物理化学(理化)性质,并通过重均相对分子质量(weight-average relative molecular weight,Mw)变化及游离多糖变化比较结合物稳定性;用原始多糖和结合物分别皮下免疫NIH小鼠3次,ELISA检测抗多糖IgG水平.结果Pn6A经机械剪切3、8、20次后,Mw由14.01×10^(5)g/mol分别下降为1.55×10^(5)、0.92×10^(5)和0.58×10^(5)g/mol,其对应结合物理化数据相近;核磁共振结果表明,多糖降解物和结合物各特征质子的化学位移相比原始多糖未发生改变;硫酸蒽酮法和速率比浊法定量计算得到的不同多糖和结合物单位抗原值相近;在不同pH及温度条件下,长链多糖及其结合物的Mw和游离多糖变化均大于短链多糖.不同链长多糖结合物免疫小鼠后诱导的IgG抗体滴度均高于原始多糖(F=2.90,P=0.048),而不同结合物之间的免疫原性差异无统计学意义(F=1.39,P=0.267).结论机械剪切不会破坏Pn6A化学结构和抗原性;Pn6A链长越短,所获得的多糖及结合物越稳定;Pn6 A经机械剪切后制备的结合物在小鼠体内可诱导良好的免疫应答. 展开更多
关键词 6A型肺炎球菌荚膜多糖 核磁共振氢谱 破伤风类毒素 结合疫苗 免疫原性
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不同功能基团对3型肺炎球菌荚膜多糖免疫原性影响的初步研究 被引量：1
8
作者 赵嘉祯 蓝天 +6 位作者 代洁 张玉洁 杜游 杨溢尧 王晓倩 周觉非 崔长法 《微生物学免疫学进展》 2020年第1期30-38,共9页
目的比较3型肺炎链球菌荚膜多糖不同基团活化对多糖抗原性及结合物免疫原性的影响。方法分别采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化多糖羟基,碳二亚胺(1-(3-dimethylamino... 目的比较3型肺炎链球菌荚膜多糖不同基团活化对多糖抗原性及结合物免疫原性的影响。方法分别采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化多糖羟基,碳二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)活化多糖羧基,再与己二酰肼(adipic dihydrazide,ADH)偶联获得活化度相近的多糖衍生物。用三硝基苯磺酸方法(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)测定多糖活化度;高效液相分子排阻与多角度激光散射仪联用(HPLC-SEC-MALLS)分析衍生物分子分布和大小;Zeta电位仪与滴定仪联用分析其表面电荷变化;速率比浊法和免疫双扩散法比较其抗原性变化;利用多糖衍生物与载体蛋白偶联获得的不同结合物免疫小鼠,间接ELISA分析不同结合物免疫后的IgG抗体浓度,进一步阐述活化过程中多糖抗原性的变化对结合物免疫原性的影响。结果TNBS结果显示,获得同一基团不同活化度(5%~30%)、不同基团(羟基和羧基)活化度相近的多糖衍生物;等电点分析结果显示,不同基团的活化会导致多糖表面不同的电荷变化;而速率比浊和免疫双扩散的结果显示,多糖羟基的活化会导致多糖抗原性略有下降,但不同活化度之间差异较小;在相似活化度情况下,羧基衍化物的抗原性更低,随着羧基活化度的增加,多糖抗原性下降明显(约60%)。小鼠ELISA结果显示,对羧基不同程度活化得到的结合物,其免疫原性较多糖明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05);随着多糖羧基活化度的增加,结合物免疫原性先增加后降低。结论3型多糖重复单位上的羧基的改变对抗原性影响较羟基更大,对羧基的过度活化会影响结合物的免疫原性。 展开更多
关键词 肺炎链球菌 肺炎血清型3荚膜多糖 结合疫苗 1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸 羟基 羧基 抗原性 免疫原性
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磷酸铝佐剂对9V型肺炎球菌多糖结合物的免疫促进及琥珀酸的影响 被引量：1
9
作者 杨溢尧 刘威 +5 位作者 邹莎莎 曾华英 张伟 赵雪琪 杜游 崔长法 《国际生物制品学杂志》 CAS 2022年第2期70-75,共6页
目的探讨不同性质的磷酸铝佐剂对9V型肺炎球菌多糖(Streptococcus pneumococcal 9V polysaccharide,9V-PS)结合物的免疫促进作用,及琥珀酸对免疫应答的影响。方法采用3种磷酸铝佐剂与9V-PS结合物制备疫苗,另外在相同配方的疫苗中加入琥... 目的探讨不同性质的磷酸铝佐剂对9V型肺炎球菌多糖(Streptococcus pneumococcal 9V polysaccharide,9V-PS)结合物的免疫促进作用,及琥珀酸对免疫应答的影响。方法采用3种磷酸铝佐剂与9V-PS结合物制备疫苗,另外在相同配方的疫苗中加入琥珀酸,同时将无佐剂的9V-PS结合物作为对照。用所制疫苗皮下免疫小鼠,收集不同针次免疫后血清,ELISA测定免疫后小鼠血清中抗9V-PS IgG抗体浓度。结果采用不同磷酸铝佐剂的3种疫苗之间比较,小鼠血清中抗9V-PS IgG抗体浓度差异无统计学意义(t值为0.38~0.86,P值均>0.05)。磷酸铝佐剂配伍的疫苗与无佐剂组相比,小鼠血清中抗9V-PS IgG抗体浓度均显著提高,差异有统计学意义(t值为3.75~4.35,P值均<0.05);佐剂A和B组加入琥珀酸与未加入比较,小鼠血清中抗9V-PS IgG抗体浓度差异无统计学意义(t值分别为1.39、0.45,P值均>0.05)。结论磷酸铝佐剂可以显著提高9V-PS结合物的免疫应答。不同磷酸铝佐剂的免疫促进作用无明显差异。添加琥珀酸对免疫应答不产生明显影响。 展开更多
关键词 佐剂 免疫 肺炎球菌菌苗 磷酸铝 琥珀酸
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响应面法优化检测己二酸二肼衍化后破伤风类毒素纯度的排阻型高效液相法
10
作者 蔡峰 马诚 +5 位作者 蓝天 陈思 周觉非 赵祥宇 杨溢尧 崔长法 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第10期1094-1098,1103,共6页
目的响应面法优化检测己二酸二肼(adipate hydrazine,ADH)衍化后破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)纯度的排阻型高效液相(SEC-HPLC)法。方法 SEC-HPLC层析柱Superdex 200 increase 3.2/300流动相为:20 mmol/L Na_2CO_3/NaHCO_3,150 mmol/... 目的响应面法优化检测己二酸二肼(adipate hydrazine,ADH)衍化后破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)纯度的排阻型高效液相(SEC-HPLC)法。方法 SEC-HPLC层析柱Superdex 200 increase 3.2/300流动相为:20 mmol/L Na_2CO_3/NaHCO_3,150 mmol/L NaCl,pH 9.0,柱温25℃,单针检测时间60 min。采用响应面法及中心复合表面设计模型(Central Composite Face-centred,CCF)对层析柱的流速、进样量、样品浓度进行优化,通过分离度、峰对称性、峰理论塔板数、单针进样时间等评价指标,确定最优色谱参数,并在最优色谱参数下连续进样100针,验证其分离效果。结果色谱柱的最优色谱条件为:流速50μl/min,进样量5μl,样品浓度1.0 mg/ml,连续进样100针各响应量均满足优化目标。结论成功采用响应面法优化了检测ADH衍化后TT纯度的SEC-HPLC法,且优化后的方法具有良好的稳定性。 展开更多
关键词 响应面法 己二酸二肼 破伤风类毒素 纯度 排阻型高效液相法
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