木聚糖酶分子结构与重要酶学性质关系的研究进展 被引量：28

1

作者 杨浩萌 姚斌 范云六 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期6-11,共6页

木聚糖是一种多聚五碳糖 ,是植物细胞中主要的半纤维素成分。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶 ,它在饲料、造纸、食品、能源工业和环境科学上有着广阔的应用前景。随着分子生物学、结构生物学的发展及蛋白质工程的应... 木聚糖是一种多聚五碳糖 ,是植物细胞中主要的半纤维素成分。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶 ,它在饲料、造纸、食品、能源工业和环境科学上有着广阔的应用前景。随着分子生物学、结构生物学的发展及蛋白质工程的应用 ,对木聚糖酶结构和功能的研究不断深入。这里重点阐述与酶的活性、热稳定性、作用pH、等电点、底物亲和性及催化效率等重要性质相关的分子结构研究进展 ,讨论了其进一步的研究发展方向。研究木聚糖酶结构与功能的关系 ,对进一步加深木聚糖酶作用机制的了解、指导木聚糖酶的分子改良有重要意义。 展开更多

关键词 木聚糖酶 结构与功能 催化残基 热稳定性 pH性质 底物亲和性

下载PDF 职称材料

通过N端替换提高木聚糖酶的热稳定性 被引量：13

2

作者 杨浩萌 孟昆 +5 位作者 罗会颖 王亚茹 袁铁铮 柏映国 姚斌 范云六 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期26-32,共7页

以来源于Thermomonospora fusca的耐高温木聚糖酶TfxA和来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB为亲本,构建出耐热高比活融合木聚糖酶TB,将TB在大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达并对表达产物的酶学性质进行分析... 以来源于Thermomonospora fusca的耐高温木聚糖酶TfxA和来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB为亲本,构建出耐热高比活融合木聚糖酶TB,将TB在大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达并对表达产物的酶学性质进行分析比较。分析表明,融合蛋白TB最适pH值为6.0,最适温度为70℃,较XYNB有大幅度的提高;在热稳定性方面,TB明显优于XYNB,将两种稀释好的酶液分别在80℃和90℃下热处理3min,TB的热稳定性较XYNB提高了6倍左右;TB的pH稳定性为5～9(相对剩余活性在50%以上的pH范围),较XYNB有所下降,但两者的比活性基本不变,保持了亲本XYNB的高比活性。通过同源建模和序列比较,分析了可能影响融合蛋白TB酶学性质的因素,为进一步研究木聚糖酶的结构与功能提供了新的思路。 展开更多

关键词 融合木聚糖酶 木聚糖酶氮端 热稳定性

下载PDF 职称材料

木聚糖酶XYNB的N46D突变、表达及酶学性质变化 被引量：12

3

作者 杨浩萌 柏映国 +5 位作者 李江 罗会颖 王亚茹 伍宁丰 范云六 姚斌 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期204-211,共8页

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.... 对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.将突变酶XYNBN46D在毕赤酵母中表达,表达的XYNBN46D经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNBN46D的最适pH值由5·2下降到4·2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,热稳定性和最适温度也有一定的提高,但酶的比活性显著下降.结果证实,木聚糖酶XYNB的第46位Asn与其最适pH值相关.对导致酶学性质改变的可能因素进行了分析,结果为进一步的结构与功能研究提供了资料. 展开更多

关键词 木聚糖酶 XYNBN46D 定点突变 pH特性

下载PDF 职称材料

N13D、S40E点突变提高木聚糖酶XYNB的热稳定性 被引量：8

4

作者 杨浩萌 王亚茹 +1 位作者 伍宁丰 姚斌 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期533-536,共4页

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后... 对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性比XYNB分别提高了24.76%和14.46%;突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22%。在其他性质方面突变酶N13D、S40E与野生型酶XYNB基本相似。通过对木聚糖酶XYNB的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。 展开更多

关键词 木聚糖酶 N13D S40E 热稳定性 定点突变

下载PDF 职称材料

木聚糖酶XYNB分子中折叠股B1和B2间的疏水作用对酶热稳定性的影响 被引量：10

5

作者 杨浩萌 姚斌 +6 位作者 罗会颖 张王照 王亚茹 袁铁铮 柏映国 伍宁丰 范云六 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期414-419,共6页

对来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模,并结合嗜热木聚糖酶氮末端芳香族氨基酸疏水作用的结构分析,设计了XYNB的T11Y定点突变,观察XYNB分子中折叠股B1和B2的疏水作用对酶的热稳定性的影响。将突变酶XYN... 对来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模,并结合嗜热木聚糖酶氮末端芳香族氨基酸疏水作用的结构分析,设计了XYNB的T11Y定点突变,观察XYNB分子中折叠股B1和B2的疏水作用对酶的热稳定性的影响。将突变酶XYNB′在毕赤酵母中表达,表达的XYNB′经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNB′的耐热性比XYNB有明显的提高,但最适温度与原酶一样为6 0℃。另外,XYNB′的最适pH、Km值及比活性均有一定的改变。实验证实了木聚糖酶XYNB的氮端芳香族氨基酸之间的疏水相互作用与其热稳定性相关,为进一步的结构与功能研究提供了优良的基因材料。 展开更多

关键词 木聚糖酶XYNB 定点突变 热稳定性

下载PDF 职称材料

饲用木聚糖酶的研究进展 被引量：6

6

作者 张王照 王亚茹 杨浩萌 《饲料广角》 2005年第15期27-28,30,共3页

关键词 木聚糖酶 饲料添加剂 分子生物学 耐热性 最适PH值 基因工程

下载PDF 职称材料

提高丝状真菌精准基因编辑效率的策略

7

作者 杨浩萌 梁丽存 +4 位作者 宋祖洹 徐欣欣 罗会颖 姚斌 黄火清 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1425-1440,共16页

基因编辑技术的应用使对丝状真菌进行高效、精准的基因改造成为可能。然而,在实际实验操作过程中,仍然存在很多影响因素,导致同源重组介导的精准基因编辑的效率很低。本文对目前提高丝状真菌精准编辑效率的方法进行了总结,使基因编辑方... 基因编辑技术的应用使对丝状真菌进行高效、精准的基因改造成为可能。然而,在实际实验操作过程中,仍然存在很多影响因素,导致同源重组介导的精准基因编辑的效率很低。本文对目前提高丝状真菌精准编辑效率的方法进行了总结,使基因编辑方法更好地应用于丝状真菌的菌种改造。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas 精准编辑 同源重组 非同源末端连接

原文传递

化学试剂对塔宾曲霉同源重组效率的影响

8

作者 梁丽存 刘文龙 +3 位作者 刘晓青 姚斌 黄火清 杨浩萌 《生物技术进展》 2024年第4期586-593,共8页

某些化学试剂可以通过调节细胞周期或胞内DNA修复途径来提高基因编辑效率。以塔宾曲霉作为研究对象,通过CRISPR/Cas9工具,对其孢子色素合成相关基因fwn进行基因编辑,在转化过程中分别加入8种化学试剂,最后通过统计孢子颜色和抗性基因PC... 某些化学试剂可以通过调节细胞周期或胞内DNA修复途径来提高基因编辑效率。以塔宾曲霉作为研究对象,通过CRISPR/Cas9工具,对其孢子色素合成相关基因fwn进行基因编辑,在转化过程中分别加入8种化学试剂,最后通过统计孢子颜色和抗性基因PCR验证,检测8种化学试剂对塔宾曲霉同源重组效率的影响。结果发现,与零添加对照组相比,在原生质体转化过程中,添加苯菌灵(benomyl)、RS-1、香草醛(vanillin)和氯丙嗪(chlorpromazine),同源重组效率分别达到85.45%、60.90%、59.45%、65.95%,比对照组提高了18.05%、9.35%、7.9%、14.4%;当苯菌灵与其他试剂叠加使用时,同源重组效率进一步提高,最高可达97.92%。因此,化学试剂在原生质体转化中的应用为提高丝状真菌的基因编辑效率提供了新的思路。 展开更多

关键词 化学试剂 同源重组效率 塔宾曲霉

下载PDF 职称材料

白地霉ch-3低温脂肪酶基因的克隆与表达 被引量：3

9

作者 付建红 姚斌 +2 位作者 杨浩萌 黄火清 石玉瑚 《生物技术》 CAS CSCD 2007年第5期25-29,共5页

目的:脂肪酶是世界主要工业用酶制剂之一,用基因工程方法克隆与表达白地霉(Geotrichum candidum)ch-3菌株的低温脂肪酶基因。方法:用PCR方法从白地霉ch-3的总DNA中扩增得到一种低温脂肪酶基因lip,将PCR产物连接到pBluescriptⅡSK(+)载体... 目的:脂肪酶是世界主要工业用酶制剂之一,用基因工程方法克隆与表达白地霉(Geotrichum candidum)ch-3菌株的低温脂肪酶基因。方法:用PCR方法从白地霉ch-3的总DNA中扩增得到一种低温脂肪酶基因lip,将PCR产物连接到pBluescriptⅡSK(+)载体上,测序证明正确后再将基因lip插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9α中,含有目的基因的重组质粒在毕赤酵母中进行诱导表达。结果:毕赤酵母成功表达了lip基因,其活性为37U/mL。SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶蛋白相对分子质量约62kDa,比推测分子量大,lip的表达产物可能被糖基化修饰。初步研究表明:重组脂肪酶最适温度为35℃,在0℃仍可保持66%的相对酶活性,对热敏感。结论:实现了低温脂肪酶在毕赤酵母的成功表达,为进一步研究低温酶催化机制和工业化应用打下基础。 展开更多

关键词 白地霉ch-3 低温脂肪酶 基因克隆 巴斯德毕赤酵母 表达

下载PDF 职称材料

利用叶绿素荧光评估草原植物羊草缺磷缺氮状况 被引量：3

10

作者 李玲玉 杨浩萌 +2 位作者 任为波 吴新宏 黄芳 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期271-277,共7页

羊草(Leymus chinensis)是北方草原的重要牧草。准确评估其营养状况,对维护羊草草原的生产力具有重要意义。以羊草幼苗为材料,利用能同时表征2个光系统光化学活性的叶绿素荧光检测技术,对缺氮和缺磷处理下的叶片光化学活性进行分析。结... 羊草(Leymus chinensis)是北方草原的重要牧草。准确评估其营养状况,对维护羊草草原的生产力具有重要意义。以羊草幼苗为材料,利用能同时表征2个光系统光化学活性的叶绿素荧光检测技术,对缺氮和缺磷处理下的叶片光化学活性进行分析。结果表明,缺氮处理20天后羊草叶片叶绿素含量降低近50%。同期缺磷及缺氮处理对PSⅡ功能的影响总体大于PSⅠ。与对照相比,缺氮叶片的Φ(Ⅱ)和Φ(Ⅰ)分别比对照降低了30.3%与38.5%;ETR(Ⅱ)与ETR(Ⅰ)分别降低30.8%和28.9%。缺磷处理组Φ(Ⅱ)和ETR(Ⅱ)的降低幅度约为缺氮的1/2。这些定量研究结果对及时有效地诊断和区分羊草植物氮磷缺乏状况具有重要的参考价值。 展开更多

关键词 羊草 缺氮 缺磷 PSⅡ PSⅠ

原文传递

集胞藻Slr1515基因提高转基因水稻植株剑叶长度及叶绿素含量 被引量：2

11

作者 杨浩萌 薛哲勇 +2 位作者 赵乐 漆小泉 黄芳 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期489-497,共9页

蓝藻是古老的原核光合生物,不仅在植物进化上有重要地位,也是可利用的生物资源及重要的基因资源。Slr1515是来源于集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)的基因,其同源基因在蓝藻中普遍存在,但对其生物学功能所知有限。以易于转化的水... 蓝藻是古老的原核光合生物,不仅在植物进化上有重要地位,也是可利用的生物资源及重要的基因资源。Slr1515是来源于集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)的基因,其同源基因在蓝藻中普遍存在,但对其生物学功能所知有限。以易于转化的水稻品种中花11(Oryza sativa subsp.japonica cv.‘Zhonghua 11’)为材料,通过农杆菌介导的遗传转化方法将Slr1515基因导入水稻胚性愈伤组织中。经过诱导分化,获得了一系列转基因幼苗。通过PCR、GFP荧光及免疫印迹检测,筛选出单拷贝插入的转基因阳性株系,并对野生型和转基因株系的表型进行比较分析。结果表明,灌浆期转基因株系的剑叶长度比同期的野生型提高了27.7%。进一步的测定结果显示,转基因株系的剑叶叶绿素含量和PSII最大量子产率分别比野生型提高了0.65倍和4.4%。推测Slr1515基因可能在改善水稻农艺性状方面有一定价值。 展开更多

关键词 叶绿素含量 剑叶长度 水稻 Slr1515 蓝藻

原文传递

集胞藻sbtA基因具有提高水稻旗叶叶绿素含量及株高的功能 被引量：2

12

作者 杨浩萌 薛哲勇 +2 位作者 赵乐 漆小泉 黄芳 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期351-356,共6页

SbtA是蓝藻特有的碳酸氢盐转运蛋白,在蓝藻二氧化碳浓缩机制中起重要作用。本研究以水稻‘中花11’为材料,采用农杆菌介导的转化方法将集胞藻的sbtA基因导入水稻胚性愈伤组织中,再经诱导分化获得转基因幼苗。通过PCR、GFP荧光检测及West... SbtA是蓝藻特有的碳酸氢盐转运蛋白,在蓝藻二氧化碳浓缩机制中起重要作用。本研究以水稻‘中花11’为材料,采用农杆菌介导的转化方法将集胞藻的sbtA基因导入水稻胚性愈伤组织中,再经诱导分化获得转基因幼苗。通过PCR、GFP荧光检测及Western blot检测筛选单拷贝插入的转基因阳性株系,并对其表型进行比较分析。结果表明,转基因水稻株高和旗叶的叶绿素含量显著提高,与野生型相比分别增加了11.9%和27%。后一表型暗示sbtA基因可能在延缓灌浆期水稻旗叶衰老及改善水稻农艺性状方面具有潜在的应用价值。 展开更多

关键词 集胞藻 sbtA 水稻 叶绿素含量 株高

原文传递

羊草对磷饥饿胁迫的光化学响应特性 被引量：2

13

作者 李玲玉 杨浩萌 +2 位作者 任卫波 吴新宏 黄芳 《中国草地学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期111-115,共5页

以羊草幼苗为材料,利用叶绿素荧光检测技术,对同期缺磷(0μmol/L)和低磷(2.5μmol/L)胁迫处理的叶片光化学活性进行了比较,结果表明:与对照相比,光系统Ⅱ实际量子效率Φ(Ⅱ)及相对电子传递速率ETR(Ⅱ)分别降低42.9%和38.1%,约为低磷处... 以羊草幼苗为材料,利用叶绿素荧光检测技术,对同期缺磷(0μmol/L)和低磷(2.5μmol/L)胁迫处理的叶片光化学活性进行了比较,结果表明:与对照相比,光系统Ⅱ实际量子效率Φ(Ⅱ)及相对电子传递速率ETR(Ⅱ)分别降低42.9%和38.1%,约为低磷处理降低幅度(19.6%,20.4%)的两倍,表明缺磷比低磷引起的PSⅡ活性降低更多。两种处理下光系统Ⅰ的实际量子效率Φ(Ⅰ)分别比对照降低25.4%和28.8%,表明它们对PSⅠ功能的影响程度相当。进一步对非光化学淬灭系数NPQ及环式电子传递速率的比较发现,缺磷胁迫下二者增加的幅度最大,可达对照的3.48倍和1.77倍,推测这是羊草植物缺磷胁迫下光保护的重要方式。 展开更多

关键词 羊草 磷饥饿 光强响应 光化学

下载PDF 职称材料

应用于基因编辑的核糖核蛋白复合体的构建与活性验证 被引量：2

14

作者 高伟欣 黄火清 +3 位作者 赵晶 张鑫 杨宁 杨浩萌 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期60-68,共9页

CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点,已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究。在该技术体系中,发挥核酸剪切功能的是Cas9蛋白和guideRNA(gRNA)组装而成的核糖核蛋白复合体,即RNP(ribonucleop... CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点,已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究。在该技术体系中,发挥核酸剪切功能的是Cas9蛋白和guideRNA(gRNA)组装而成的核糖核蛋白复合体,即RNP(ribonucleoprotein)复合体。目前,应用体外组装的RNP复合体直接递送进入受体细胞进行基因编辑的研究越来越多,成为提高编辑效率、降低脱靶率的有效手段。本研究以获得具有高效剪切活性的RNP复合体为试验目的,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了Cas9蛋白,并通过His-tag亲和树脂对重组Cas9蛋白进行了纯化;同时,通过T7转录试剂盒对gRNA进行体外转录和纯化,使纯化的Cas9蛋白和gRNA自发组装成RNP复合体,经体外活性检测,RNP复合体具有很好的DNA双链剪切活性;将其与donor DNA共同转化到黑曲霉菌株,成功敲除了目标蛋白,编辑效率达到90%以上。本研究获得的RNP复合体,可以应用于丝状真菌的基因编辑,节约了试验时间与成本,并推动RNP介导的基因编辑技术在更多领域的应用。 展开更多

关键词 Cas9蛋白 RNP复合体 大肠杆菌 活性验证

下载PDF 职称材料

来源于Penicillium sp.C1的水产用中性植酸酶基因在毕赤酵母中的表达及性质研究 被引量：1

15

作者 李雅楠 余利红 +2 位作者 陈新美 杨浩萌 黄火清 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期134-141,共8页

通过简并引物和TAIL-PCR技术从青霉Penicillium sp. C1菌株的基因组DNA中克隆得到一个新的植酸酶基因,命名为phyC1。其结构基因全长1 477 bp,5’端包含58 bp的内含子序列,该基因编码472个氨基酸和一个终止密码子,前23个氨基酸为信号肽。... 通过简并引物和TAIL-PCR技术从青霉Penicillium sp. C1菌株的基因组DNA中克隆得到一个新的植酸酶基因,命名为phyC1。其结构基因全长1 477 bp,5’端包含58 bp的内含子序列,该基因编码472个氨基酸和一个终止密码子,前23个氨基酸为信号肽。将PhyC1的成熟蛋白的编码基因在毕赤酵母菌GS115中高效分泌表达,重组蛋白经硫酸铵沉淀和阴离子交换柱和分子筛纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明:重组植酸酶PhyC1最适pH为6.5,在pH5.0-10.0的条件下具有较好的稳定性;重组植酸酶PhyC1最适温度为50℃。与现有商品植酸酶相比,PhyC1具有两个显著的特性,如低温条件下具有高活性,尤其是在低于20℃时;在中性pH 7.0条件下仍具有90%以上的相对酶活性,因此,植酸酶PhyC1的优良特性为其在水产行业的应用奠定基础。 展开更多

关键词 中性植酸酶 水产用酶 青霉 毕赤酵母

下载PDF 职称材料

白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

16

作者 付建红 姚斌 +2 位作者 杨浩萌 欧阳平凯 石玉瑚 《生物加工过程》 CAS CSCD 2008年第3期68-73,共6页

构建了白地霉脂肪酶Ⅰ的基因工程菌,为进一步进行蛋白质工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。从新疆昌吉市油脂化工厂含油冻土中分离得到1株低温脂肪酶产生菌-白地霉ch-3。该菌发酵上清液中的脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃仍可保持66%的... 构建了白地霉脂肪酶Ⅰ的基因工程菌,为进一步进行蛋白质工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。从新疆昌吉市油脂化工厂含油冻土中分离得到1株低温脂肪酶产生菌-白地霉ch-3。该菌发酵上清液中的脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃仍可保持66%的相对酶活力。应用PCR技术从白地霉ch-3基因组DNA中克隆得到脂肪酶Ⅰ基因lip1,将该基因与原核表达质粒载体pET-22b(+)连接,构建重组质粒pETl-ip1,转化E.coliBL21(DE3),酶切鉴定,筛选得到重组菌。十二烷基磺酸钠-聚丙希酰胺(SDS-PAGE)显示重组脂肪酶Ⅰ的相对分子质量约为5.8×104,酶活为2.73 U/mL,表明lip1基因的表达产物具有正常的生物学活性。白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因lip1能够在大肠杆菌中有效地表达。 展开更多

关键词 大肠杆菌 白地霉ch-3 脂肪酶 基因克隆

下载PDF 职称材料