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人类Munc18-1重组质粒的构建及蛋白表达和定位
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作者 吴怡 王婧 +1 位作者 王岚 杨卫静 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 CAS 2015年第6期430-433,共4页
目的构建人类Munc18-1(hMunc18-1)真核表达质粒pEGFP-hMunc18-1并检测其融合蛋白GFPhMunc18-1在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库中的cDNA为模板,聚合酶链反应PCR扩增hMunc18-1全长编码基因,亚克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEG... 目的构建人类Munc18-1(hMunc18-1)真核表达质粒pEGFP-hMunc18-1并检测其融合蛋白GFPhMunc18-1在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库中的cDNA为模板,聚合酶链反应PCR扩增hMunc18-1全长编码基因,亚克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中。将构建的重组质粒pEGFPhMunc18-1送到Invitrogen公司进行基因测序,根据NCBI数据库中的hMunc18-1基因序列判断所得重组质粒的基因序列是否正确。将测序正确的质粒pEGFP-hMunc18-1转染到非洲绿猴肾细胞COS-7细胞中,提取细胞蛋白以Western blot法检测融合蛋白GFP-hMunc18-1表达,利用共聚焦激光扫描显微镜观察其在非洲绿猴肾细胞COS-7内的定位。结果 hMunc18-1全长基因序列被成功克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,经酶切后鉴定其片段大小为1785bp。Western blot检测到融合蛋白GFP-hMunc18-1相对分子质量约为94 000,主要分布在细胞质,尤其是细胞膜附近。结论成功构建了hMunc18-1全长基因真核表达质粒pEGFPhMunc18-1,其融合蛋白GFP-hMunc18-1主要定位于COS-7细胞质内,尤其是细胞膜附近。 展开更多
关键词 Munc18-1 WESTERN BLOT 绿色荧光蛋白 质粒构建
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