毕赤酵母表达系统研究进展 被引量：18

1

作者 齐连权 陈薇 +2 位作者 来大志 于长明 王海涛 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2002年第6期45-47,共3页

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题 ,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题 ;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键... 毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题 ,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题 ;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。至今已有多种外源蛋白在该表达系统中成功表达。下面对毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作一简要综述。 展开更多

关键词 毕赤酵母 表达系统 研究进展

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改造中国仓鼠卵巢细胞 被引量：8

2

作者 来大志 齐连权 +2 位作者 于长明 王海涛 陈薇 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期415-419,共5页

与原核细胞、酵母细胞以及昆虫细胞相比 ,中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)作为宿主细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象 ,因而CHO细胞表达系统是生物工程制药最为理想的表达系统。但这种系统也存在诸多缺点。如在大规模培养中CHO细胞会面临着对... 与原核细胞、酵母细胞以及昆虫细胞相比 ,中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)作为宿主细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象 ,因而CHO细胞表达系统是生物工程制药最为理想的表达系统。但这种系统也存在诸多缺点。如在大规模培养中CHO细胞会面临着对无血清培养基的适应性差、细胞无限度增殖以及细胞凋亡等很多难题。所以除了在培养基、培养条件和表达载体方面下功夫优化该系统外 ,对CHO细胞本身进行改造已成为优化CHO表达系统的另一热点。 展开更多

关键词 改造 中国仓鼠卵巢细胞 CHO细胞 大规模培养 细胞凋亡 细胞黏附 细胞周期

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用于生产重组蛋白药物的抗凋亡CHO宿主细胞株的建立 被引量：6

3

作者 来大志 付玲 +5 位作者 于长明 齐连权 翁少洁 于婷 王海涛 陈薇 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期322-326,共5页

哺乳动物工程细胞在大规模培养生产重组蛋白时很容易发生细胞凋亡 ,从而导致生产过程提前终止 ,造成生产成本高昂。细胞代谢产物氨已被证明可以促进细胞凋亡 ,而线粒体膜整合蛋白Bcl 2可以通过促进线粒体膜完整性而抑制细胞凋亡。本实... 哺乳动物工程细胞在大规模培养生产重组蛋白时很容易发生细胞凋亡 ,从而导致生产过程提前终止 ,造成生产成本高昂。细胞代谢产物氨已被证明可以促进细胞凋亡 ,而线粒体膜整合蛋白Bcl 2可以通过促进线粒体膜完整性而抑制细胞凋亡。本实验应用谷氨酰胺合成酶加压系统在CHO工程细胞中高效表达中国仓鼠Bcl 2蛋白 ,使细胞具有抗凋亡能力的同时 ,利用谷氨酸和氨合成谷氨酰胺而有效降低培养基中氨的含量 。 展开更多

关键词 细胞凋亡 CHO细胞 谷氨酰胺合成酶 氨 重组蛋白药物 哺乳动物细胞 表达系统

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两个新型多拷贝毕赤酵母表达载体的构建 被引量：4

4

作者 齐连权 陈薇 +3 位作者 于长明 来大志 翁少洁 王海涛 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2002年第4期264-266,共3页

目的 :构建合适的载体用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法 :利用PCR技术 ,对已有载体pPIC9K进行改造 :在多克隆位点处增加一个NaeⅠ酶切位点 ;去除卡那霉素抗性基因中的一个XhoⅠ酶切位点。结果和结论 :成功地构建了pM... 目的 :构建合适的载体用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法 :利用PCR技术 ,对已有载体pPIC9K进行改造 :在多克隆位点处增加一个NaeⅠ酶切位点 ;去除卡那霉素抗性基因中的一个XhoⅠ酶切位点。结果和结论 :成功地构建了pMEN9K ,pMEX9K两个载体 。 展开更多

关键词 巴斯德毕赤酵母 载体 基因表达 PCR

原文传递

人β干扰素基因的改构及其融合表达和纯化 被引量：2

5

作者 来大志 陈薇 +4 位作者 付玲 齐连权 于长明 翁少洁 王海涛 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2002年第1期21-23,共3页

目的 :通过基因改构来提高人 β干扰素基因原核表达产物的稳定性和比活性。 方法 :用RT_PCR法从人外周血淋巴细胞中获得人 β干扰素基因。定点突变后 ,克隆至表达载体pGEX_2T。IPTG诱导该基因的表达 ,亲和层析和原位裂解法纯化表达产物... 目的 :通过基因改构来提高人 β干扰素基因原核表达产物的稳定性和比活性。 方法 :用RT_PCR法从人外周血淋巴细胞中获得人 β干扰素基因。定点突变后 ,克隆至表达载体pGEX_2T。IPTG诱导该基因的表达 ,亲和层析和原位裂解法纯化表达产物。结果 :获得大量纯化产物 ,且稳定性和活性获得极大提高。结论 :基因改构可以提高人 展开更多

关键词 Β干扰素 基因改构 稳定性 比活性 RT-PCR Β干扰素 融合表达 纯化

原文传递

复合干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及活性分析 被引量：3

6

作者 于长明 齐连权 +5 位作者 来大志 张晓鹏 孔毅荣 于婷 付玲 陈薇 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期113-116,共4页

目的　在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法　根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,线性化后转化毕赤酵母GS115 ,筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过滤... 目的　在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法　根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,线性化后转化毕赤酵母GS115 ,筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过滤三步层析纯化 ,用细胞病变抑制法测定其活性 ,并结合lowry法蛋白定量计算其比活性。结果　SDS PAGE分析显示 ,重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中 ,经纯化后纯度达到 96 % ,其N端氨基酸序列与理论值一致 ,比活与干复津相当。结论　复合干扰素在毕赤酵母中获得高效分泌表达 。 展开更多

关键词 复合干扰素 毕赤酵母 基因表达

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通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养 被引量：4

7

作者 来大志 翁少洁 +4 位作者 齐连权 于长明 付玲 于婷 陈薇 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期66-72,共7页

哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中 ,哺乳动物细胞生长活力差 ,且容易发生细胞凋亡 ,因而难以大规模培养。为解决此问题 ,应用双顺反子表达载体在CHO dhfr- 细胞中同时表达Igf 1 Bcl 2或Bcl ... 哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中 ,哺乳动物细胞生长活力差 ,且容易发生细胞凋亡 ,因而难以大规模培养。为解决此问题 ,应用双顺反子表达载体在CHO dhfr- 细胞中同时表达Igf 1 Bcl 2或Bcl 2 CyclinE基因组合 ,通过Bcl 2使细胞获得抗凋亡能力 ;通过Igf 1或CyclinE促进细胞生长分裂 ,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO dhfr- 细胞 ,应用Westernblot从G4 18抗性克隆中分别筛选到Bcl 2高表达克隆若干个 ,对其中表达Bcl 2最高的CHO IB3和CHO BC1做进一步Westernblot和流式细胞分析 ,确认此两个细胞株分别高表达Igf 1 Bcl 2和Bcl 2 CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡 ,并以流式细胞术和DNALadder法检测细胞凋亡 ,证明CHO IB3和CHO BC1均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO dhfr- 对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明 ,CHO IB3和CHO BC1在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO dhfr- 对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长 ,适于作为生物工程宿主细胞。 展开更多

关键词 哺乳动物细胞表达系统 细胞培养 细胞凋亡 细胞周期 无蛋白培养基

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应用人延伸因子1α亚基启动子和人工转录激活因子提高外源基因在CHO细胞中的表达 被引量：4

8

作者 来大志 翁少洁 +4 位作者 于长明 齐连权 付玲 于婷 陈薇 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第2期118-126,共9页

表达载体的设计对于提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达量十分重要 .而表达载体中最为重要的元件是启动子 .一些常用病毒来源的启动子 ,如巨细胞病毒即早期启动子 (PCMV IE)仅在S期激活 ,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增... 表达载体的设计对于提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达量十分重要 .而表达载体中最为重要的元件是启动子 .一些常用病毒来源的启动子 ,如巨细胞病毒即早期启动子 (PCMV IE)仅在S期激活 ,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖 ,这对于连续持久大规模培养的宿主细胞不现实 .而人延伸因子 1α亚基启动子 (PEF 1α)不受细胞周期限制 ,且启动子强度高于PCMV IE,对于大规模外源蛋白的生产较为理想 .首先构建了基于PEF 1α启动子的哺乳动物细胞表达载体pED5 ,在增殖缓慢的CHO细胞中 ,此载体表达外源蛋白的能力是应用PCMV IE启动子表达载体的 4 1倍 .由于启动子一般仅能决定基因转录的本底水平 ,而转录激活因子 (transcriptionactivators)对基因转录的影响更大 ,所以另把两个人工转录激活结构域AH和VP2接到λ噬菌体cⅠ蛋白的C端 ,它们通过cⅠ蛋白结合于已插入到PEF 1α启动子的TATA框上游约 2 0 0bp的λ噬菌体OR2 OR1序列上 ,而被“征募”到PEF 1α启动子TATA框附近 ,从而促进基因的转录 .把上述元件均整合进一个表达载体中 ,构建了两个新型表达载体pER AH和pER VP2 .pER AH表达外源蛋白的能力比不含转录激活因子的表达载体略高 ,而pER VP2表达外源蛋白的能力则比不含转录激活因子的表达载体高 展开更多

关键词 人工转录激活因子 人延伸因子1α亚基启动子 基因表达 cI蛋白 CHO细胞

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复合干扰素突变体在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析 被引量：2

9

作者 于长明 付玲 +5 位作者 齐连权 张晓鹏 于婷 来大志 王海涛 陈薇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期317-320,共4页

根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素突变体基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,将重组载体pMEX CIFNm用SacⅠ线性化后 ,转化毕赤酵母GS115 .转化子经诱导后 ,培养上清有抗病毒活性的蛋白产生 .经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过... 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素突变体基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,将重组载体pMEX CIFNm用SacⅠ线性化后 ,转化毕赤酵母GS115 .转化子经诱导后 ,培养上清有抗病毒活性的蛋白产生 .经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过滤三步层析纯化 ,得到了纯度大于95 %的重组复合干扰素突变体 ,经N端氨基酸序列分析表明 ,该蛋白N端序列与理论值一致 ,质谱测定分子量为 19 3kD ,与理论值一致 .用细胞病变抑制法测定其活性 ,并结合Lowry法蛋白定量计算其比活性为 6× 10 8IU mg ,与复合干扰素的比活相当 . 展开更多

关键词 毕赤酵母 表达 纯化 活性 复合干扰素突变体基因

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适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建 被引量：4

10

作者 翁少洁 来大志 +3 位作者 齐连权 于长明 付玲 陈薇 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期745-749,共5页

应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬... 应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中 ,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达Igf_1和Bcl_2基因 ,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO_IB3。在此基础上 ,构建了可以同时表达Igf_1、Vitronectin和Bcl_2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI_NII_IVB。将该载体转染于CHO_dhfr- 细胞中 ,构建了一个细胞株CHO_IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长 ,适于以贴壁的方式大规模培养 。 展开更多

关键词 CHO细胞 细胞工程 细胞凋亡 贴壁培养 无血清培养基

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表位水平研究病毒流行病学的方法探讨 被引量：2

11

作者 来大志 杜勇 +2 位作者 杜桂鑫 陈薇 王海涛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期331-334,共4页

应用噬菌体随机展示肽库和硫氧还蛋白表面展示技术 ,建立了在表位水平研究病毒流行病学的方法 ,并以丙型肝炎病毒核心区蛋白做了初步验证 。

关键词 表位 流行病学 肽库 噬菌体 硫氧还蛋白 表面展示 HCV

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人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究 被引量：1

12

作者 徐春娥 付玲 +6 位作者 侯丽华 翁少洁 来大志 李健民 于婷 于长明 陈薇 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期6-10,共5页

3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白,分别主要由SARS基因组中ORF3a和ORF7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构,除去了SV40启动子基因,获得了pGL3-Enhancer载体,将获得的... 3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白,分别主要由SARS基因组中ORF3a和ORF7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构,除去了SV40启动子基因,获得了pGL3-Enhancer载体,将获得的IFN-β启动子基因连入载体中,构建了带有人IFN-β启动子基因的荧光素酶报告质粒IP-21,并且通过实验证明所构建的质粒在干扰素的诱导剂NDV的作用下能够表达荧光素酶活性,照度计检测荧光素酶活性增强,从而验证了所构建的重组质粒的有效性。为了观察SARS-CoV非结构蛋白3a和7a对干扰素诱生途径的影响,将IP-21瞬转入稳定表达有3a和7a蛋白的CHO细胞,通过荧光素酶的信号强弱对3a和7a的作用进行分析,结果表明SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达,即在体外的细胞实验中,3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。此结果对进一步研究3a和7a的功能以及对SARS-CoV的致病机制的进一步研究有一定意义。 展开更多

关键词 SARS-COV 3a蛋白7a蛋白 IFN-β启动子 荧光素酶报告系统

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丙型肝炎病毒RNA聚合酶可溶性和抗原性的研究 被引量：1

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作者 侯利华 杜桂鑫 +1 位作者 来大志 王海涛 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 2001年第S1期69-72,共4页

目的在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶，研究其可溶性的条件，进一步研究它的抗原性，为研究其活性打下基础。方法构建表达载体 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１。在 Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）菌株中表达。在不同诱... 目的在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶，研究其可溶性的条件，进一步研究它的抗原性，为研究其活性打下基础。方法构建表达载体 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１。在 Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）菌株中表达。在不同诱导条件下分析其可溶性，在获得ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１可溶性蛋白后，通过Ｎｉ－ＮＴＡ柱纯化。纯化后得到的目的蛋白进行ＥＬＩＳＡ和 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果在 Ｅ．ｃｏｌｉ中表达了 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△ Ｃ２１重组蛋白，二者在 ３７℃诱导条件下均以包涵体形式存在，ｐＱＥ－５Ｂ－△２１重组蛋白在１８℃诱导条件下５０％以可溶形式存在，通过ＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表明该蛋白具有抗原性。结论在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达的ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶有良好的可溶性及抗原性。 展开更多

关键词 肝炎病毒 丙型 RNA聚合酶 蛋白表达 ELISA

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李松樵和他的邮电情缘

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作者 来大志 《今日科苑》 2010年第22期28-29,共2页

李松樵是一位老邮电工作者,20岁就投身新中国的邮电事业,40年来为国家的邮电事业的长足发展立下了汗马功劳。他退休后没有放马南山、颐养天年,先后担任辽宁省通信学会三届、四届理事长、五届名誉理事长,辽宁邮电老科技工作者协会会长。... 李松樵是一位老邮电工作者,20岁就投身新中国的邮电事业,40年来为国家的邮电事业的长足发展立下了汗马功劳。他退休后没有放马南山、颐养天年,先后担任辽宁省通信学会三届、四届理事长、五届名誉理事长,辽宁邮电老科技工作者协会会长。他对邮电事业倾注了一生的情感和抱负。当春去秋来,他总是难以忘记一段段流金岁月,并把自己的记忆定格在那激情燃烧的时代…… 展开更多

关键词 邮电事业 名誉理事长 科技工作者 松 辽宁省 新中国

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