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一种用于Red同源重组的正反筛选表达盒的构建及其反向筛选性能分析
被引量：
1
1
作者
刘金泽
刘云惠
+6 位作者
余子豪
李
永霞
王明晓
张远星
李
统战
李
倩文
余旭平
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第10期902-907,共6页
为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法,本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因(str^S,即rpsL基因)和卡那抗性基因(kan^R),采用重叠延伸PCR方法将str^S基因和kan^R基因拼接,并将拼接片段分别克隆于pMD1...
为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法,本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因(str^S,即rpsL基因)和卡那抗性基因(kan^R),采用重叠延伸PCR方法将str^S基因和kan^R基因拼接,并将拼接片段分别克隆于pMD18-T和pBAD33载体中,再以重组载体为模板,以带有flgK基因同源臂的引物扩增获得Placstr^S-kan^R打靶片段和Parastr^S-kan^R打靶片段,然后结合Red重组技术构建了相应的flgK基因敲除菌株placSK-ΔflgK/TOP10和paraSK-ΔflgK/TOP10,并通过链霉素最小抑菌浓度(MIC)试验检测两种筛选系统的反向筛选性能。结果显示,野生型TOP10菌株、placSK-ΔflgK/TOP10菌株和paraSK-ΔflgK/TOP10菌株的链霉素MIC值分别为8 000μg/mL、2 000μg/mL和500μg/mL。表明采用两种筛选系统构建的敲除菌株均有一定的链霉素敏感表型,具有反向筛选的能力,但含Para启动子的筛选系统反向筛选性能更好。本研究建立了可用于大肠杆菌Red重组技术的反向筛选系统,为获得更有效的Red重组筛选工具提供了依据。
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关键词
RED重组
RPSL基因
基因敲除
大肠杆菌
flgK基因
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职称材料
三种噬菌体裂解基因对大肠杆菌致死效果的比较
被引量：
1
2
作者
张远星
李
统战
+3 位作者
余子豪
查帆
李
倩文
余旭平
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第12期1268-1274,共7页
为比较3种噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E对大肠杆菌的致死效果,本研究将噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E克隆于严谨调控的高效表达载体pN15E6中,构建重组质粒pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE和pN15E6-E,分别转化入JM109和DH31soplacI二种大肠...
为比较3种噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E对大肠杆菌的致死效果,本研究将噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E克隆于严谨调控的高效表达载体pN15E6中,构建重组质粒pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE和pN15E6-E,分别转化入JM109和DH31soplacI二种大肠杆菌中,观察重组大肠杆菌在含IPTG诱导剂平板培养基上的生长情况,判定M-lysis、mE、E基因过表达对大肠杆菌宿主的影响。结果显示,在大肠杆菌JM109菌株中,mE基因过表达仅表现出抑制细菌生长的效果;M-lysis基因过表达部分致死细菌,存活菌生长受到抑制;E基因过表达能够致死绝大部分细菌,但有少量耐受菌生长。在大肠杆菌DH31soplacI菌株中,M-lysis与mE基因过表达也能致死绝大部分细菌,有少量耐受菌生长;而E基因过表达则完全致死涂布于平板上经106稀释的菌株,未见任何菌落生长。将重组菌株稀释后经平板菌落计数,测得M-lysis、mE、E基因过表达后对DH31soplacI菌株致死率分别为99.03%、99.68%和99.9998%,表明E基因过表达后对宿主菌的致死作用最强;同时定期测定培养的3种重组菌OD600nm值,并绘制生长曲线,结果显示过表达E基因能够迅速致死和裂解细菌。本研究为进一步开发噬菌体裂解肽奠定基础,也为探究细菌致死机理提供了一种新模型。
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关键词
噬菌体裂解基因
过表达
致死性
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职称材料
沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达致死大肠杆菌的初探
被引量：
1
3
作者
王明晓
余子豪
+3 位作者
刘金泽
李
统战
张远星
余旭平
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第12期1100-1104,共5页
为探究沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达对大肠杆菌宿主菌的影响,本研究将鼠伤寒沙门氏菌flhDC基因克隆于具有超强调控能力的pN15E6质粒中,通过观察重组大肠杆菌在对照和含IPTG诱导剂培养基中的生长情况,初步判定flhDC基因过表达对大...
为探究沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达对大肠杆菌宿主菌的影响,本研究将鼠伤寒沙门氏菌flhDC基因克隆于具有超强调控能力的pN15E6质粒中,通过观察重组大肠杆菌在对照和含IPTG诱导剂培养基中的生长情况,初步判定flhDC基因过表达对大肠杆菌的影响。结果显示过表达flhDC双基因致死大肠杆菌宿主菌,而过表达flhD或flhC单个基因不致死宿主菌,同一细胞中同时过表达flhD和flhC两个基因致死宿主菌;为探究沙门氏菌flhDC基因在大肠杆菌中的调控功能,本实验将flhDC基因克隆于具有严谨调控能力的p BAD33质粒中,通过测定含不同浓度阿拉伯糖半固体培养基上重组大肠杆菌菌落的直径,评估沙门氏菌flhDC在大肠杆菌宿主菌中调控鞭毛活性的能力。结果显示在一定范围内随着阿拉伯糖诱导剂浓度的提高,重组菌动力增大。表明沙门氏菌flhDC基因在低浓度表达时可以促进大肠杆菌宿主菌鞭毛活性。本实验为进一步研究flhDC基因过表达致死宿主菌的机理奠定了基础。
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关键词
flhDC基因
过表达
大肠杆菌宿主茵
pNl5E6表达栽体
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职称材料
题名
一种用于Red同源重组的正反筛选表达盒的构建及其反向筛选性能分析
被引量：
1
1
作者
刘金泽
刘云惠
余子豪
李
永霞
王明晓
张远星
李
统战
李
倩文
余旭平
机构
浙江大学动物科学学院
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第10期902-907,共6页
基金
国家自然科学基金(31272582)
文摘
为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法,本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因(str^S,即rpsL基因)和卡那抗性基因(kan^R),采用重叠延伸PCR方法将str^S基因和kan^R基因拼接,并将拼接片段分别克隆于pMD18-T和pBAD33载体中,再以重组载体为模板,以带有flgK基因同源臂的引物扩增获得Placstr^S-kan^R打靶片段和Parastr^S-kan^R打靶片段,然后结合Red重组技术构建了相应的flgK基因敲除菌株placSK-ΔflgK/TOP10和paraSK-ΔflgK/TOP10,并通过链霉素最小抑菌浓度(MIC)试验检测两种筛选系统的反向筛选性能。结果显示,野生型TOP10菌株、placSK-ΔflgK/TOP10菌株和paraSK-ΔflgK/TOP10菌株的链霉素MIC值分别为8 000μg/mL、2 000μg/mL和500μg/mL。表明采用两种筛选系统构建的敲除菌株均有一定的链霉素敏感表型,具有反向筛选的能力,但含Para启动子的筛选系统反向筛选性能更好。本研究建立了可用于大肠杆菌Red重组技术的反向筛选系统,为获得更有效的Red重组筛选工具提供了依据。
关键词
RED重组
RPSL基因
基因敲除
大肠杆菌
flgK基因
Keywords
Red recombination
rpsL gene
gene knock-out
Escherichia coli
flgK gene
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
三种噬菌体裂解基因对大肠杆菌致死效果的比较
被引量：
1
2
作者
张远星
李
统战
余子豪
查帆
李
倩文
余旭平
机构
浙江大学动物科学学院
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第12期1268-1274,共7页
基金
国家自然科学基金(31272582)。
文摘
为比较3种噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E对大肠杆菌的致死效果,本研究将噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E克隆于严谨调控的高效表达载体pN15E6中,构建重组质粒pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE和pN15E6-E,分别转化入JM109和DH31soplacI二种大肠杆菌中,观察重组大肠杆菌在含IPTG诱导剂平板培养基上的生长情况,判定M-lysis、mE、E基因过表达对大肠杆菌宿主的影响。结果显示,在大肠杆菌JM109菌株中,mE基因过表达仅表现出抑制细菌生长的效果;M-lysis基因过表达部分致死细菌,存活菌生长受到抑制;E基因过表达能够致死绝大部分细菌,但有少量耐受菌生长。在大肠杆菌DH31soplacI菌株中,M-lysis与mE基因过表达也能致死绝大部分细菌,有少量耐受菌生长;而E基因过表达则完全致死涂布于平板上经106稀释的菌株,未见任何菌落生长。将重组菌株稀释后经平板菌落计数,测得M-lysis、mE、E基因过表达后对DH31soplacI菌株致死率分别为99.03%、99.68%和99.9998%,表明E基因过表达后对宿主菌的致死作用最强;同时定期测定培养的3种重组菌OD600nm值,并绘制生长曲线,结果显示过表达E基因能够迅速致死和裂解细菌。本研究为进一步开发噬菌体裂解肽奠定基础,也为探究细菌致死机理提供了一种新模型。
关键词
噬菌体裂解基因
过表达
致死性
Keywords
bacteriophage lysis gene
over-expression
lethality
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
下载PDF
职称材料
题名
沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达致死大肠杆菌的初探
被引量：
1
3
作者
王明晓
余子豪
刘金泽
李
统战
张远星
余旭平
机构
浙江大学动物科学学院
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第12期1100-1104,共5页
基金
国家自然科学基金(31272582).
文摘
为探究沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达对大肠杆菌宿主菌的影响,本研究将鼠伤寒沙门氏菌flhDC基因克隆于具有超强调控能力的pN15E6质粒中,通过观察重组大肠杆菌在对照和含IPTG诱导剂培养基中的生长情况,初步判定flhDC基因过表达对大肠杆菌的影响。结果显示过表达flhDC双基因致死大肠杆菌宿主菌,而过表达flhD或flhC单个基因不致死宿主菌,同一细胞中同时过表达flhD和flhC两个基因致死宿主菌;为探究沙门氏菌flhDC基因在大肠杆菌中的调控功能,本实验将flhDC基因克隆于具有严谨调控能力的p BAD33质粒中,通过测定含不同浓度阿拉伯糖半固体培养基上重组大肠杆菌菌落的直径,评估沙门氏菌flhDC在大肠杆菌宿主菌中调控鞭毛活性的能力。结果显示在一定范围内随着阿拉伯糖诱导剂浓度的提高,重组菌动力增大。表明沙门氏菌flhDC基因在低浓度表达时可以促进大肠杆菌宿主菌鞭毛活性。本实验为进一步研究flhDC基因过表达致死宿主菌的机理奠定了基础。
关键词
flhDC基因
过表达
大肠杆菌宿主茵
pNl5E6表达栽体
Keywords
flhDC genes
over-expression
Eschefichia coli host strain
pN15E6expression vector
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
一种用于Red同源重组的正反筛选表达盒的构建及其反向筛选性能分析
刘金泽
刘云惠
余子豪
李
永霞
王明晓
张远星
李
统战
李
倩文
余旭平
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018
1
下载PDF
职称材料
2
三种噬菌体裂解基因对大肠杆菌致死效果的比较
张远星
李
统战
余子豪
查帆
李
倩文
余旭平
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019
1
下载PDF
职称材料
3
沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达致死大肠杆菌的初探
王明晓
余子豪
刘金泽
李
统战
张远星
余旭平
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018
1
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职称材料
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