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犬细小病毒层析纯化方法的建立
1
作者 代昕宇 胡博 +6 位作者 邓效禹 张成琪 李昀真 李甜甜 孙亚杰 许丽文 白雪 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第4期49-53,共5页
病毒纯度是抗体制备和疫苗免疫效果提升的关键,本文利用Purose shell V15离子交换层析和Sepharose 4FF分子筛层析分别建立了犬细小病毒(CPV)的纯化方法。将CPV经过离心澄清和膜包浓缩后,用AKTA蛋白纯化仪结合Purose shell V15和Sepharos... 病毒纯度是抗体制备和疫苗免疫效果提升的关键,本文利用Purose shell V15离子交换层析和Sepharose 4FF分子筛层析分别建立了犬细小病毒(CPV)的纯化方法。将CPV经过离心澄清和膜包浓缩后,用AKTA蛋白纯化仪结合Purose shell V15和Sepharose 4FF分别进行纯化,最后使用超滤管浓缩,通过病毒含量测定、总蛋白回收率测定、SDS-PAGE、Western blot和电镜观察分析病毒的纯化效果。结果:2种方法纯化后病毒形态典型,病毒颗粒大小约20 nm,总蛋白去除率97%以上,回收率71%以上;Purose shell V15纯化后的病毒经SDS-PAGE和Western blot分析显示无细胞成分的杂带,而Sepharose 4FF纯化后的病毒有少量的牛血清白蛋白条带。本试验结果表明这2种方法均可用于CPV的纯化,Purose shell V15纯化后的病毒纯度更高。 展开更多
关键词 犬细小病毒 纯化 离子交换 分子筛
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犬细小病毒CPV-2c型亚洲株分离鉴定及VP2基因序列分析
2
作者 李昀真 李双双 +7 位作者 丛培强 曹海旭 鲁荣光 廉士珍 张海玲 李虹晔 胡博 白雪 《特产研究》 2024年第2期1-6,共6页
为探明北京某犬场犬的死亡原因,从患有肠道出血的犬肛拭子中分离出1株犬细小病毒,试验通过PCR、血凝和间接免疫荧光试验方法对毒株进行鉴定,并对VP2基因进行克隆测序和序列分析,确定其遗传分支。结果表明,该分离株属于犬细小病毒CPV-2c... 为探明北京某犬场犬的死亡原因,从患有肠道出血的犬肛拭子中分离出1株犬细小病毒,试验通过PCR、血凝和间接免疫荧光试验方法对毒株进行鉴定,并对VP2基因进行克隆测序和序列分析,确定其遗传分支。结果表明,该分离株属于犬细小病毒CPV-2c型,命名为CPV-BJ21株。应用犬细小病毒单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,结果为阳性;基因序列分析表明,分离株与犬细小病毒为同一进化分支,VP2基因核苷酸序列与中国四川的CPV-2c(MH476581.1)同源性达99%,与亚洲分离的犬细小病毒之间亲缘关系较近。VP2氨基酸序列在第A5G、S297A、D426E位出现了氨基酸突变;在F81细胞上传3代后,病毒液的血凝效价稳定于210。本研究可为犬细小病毒的流行情况及新疫苗的研究提供参考依据。 展开更多
关键词 犬细小病毒 分离鉴定 VP2基因 遗传进化分析
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狂犬病颗粒样疫苗的制备及免疫评价
3
作者 代昕宇 李昀真 +4 位作者 孙亚杰 胡博 张成琪 许丽文 白雪 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第7期44-51,共8页
为研发高免疫原性的新型狂犬病颗粒样疫苗,利用PCR方法扩增狂犬病病毒HEP-Flury株的G蛋白和M蛋白基因序列,将其依次克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统穿梭载体pFastBac dual上,构建重组质粒pFD-GM。制备基于pFD-GM的重组杆粒,转染至Sf9... 为研发高免疫原性的新型狂犬病颗粒样疫苗,利用PCR方法扩增狂犬病病毒HEP-Flury株的G蛋白和M蛋白基因序列,将其依次克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统穿梭载体pFastBac dual上,构建重组质粒pFD-GM。制备基于pFD-GM的重组杆粒,转染至Sf9细胞,得到重组杆状病毒rb-GM,在Sf-9细胞中表达获得病毒样颗粒VLP-GM。经SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光鉴定,重组杆状病毒成功表达了G蛋白(约56 kDa)和M蛋白(约23 kDa);经电镜观察,VLP-GM大小约为100 nm×50 nm,呈表面带有纤突的子弹形状,与典型的狂犬病病毒粒子类似。将VLP-GM免疫犬,经测定犬在二次免疫后产生较灭活疫苗更高的中和抗体水平,达到7.81 U/mL,并且与单独免疫G蛋白相比可刺激更多细胞因子如白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)生成。本研究成功表达了狂犬病病毒的病毒样颗粒VLP-GM,证明了其免疫原性,为后续的疫苗研制和抗体制备奠定了基础。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 病毒样颗粒 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
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犬细小病毒疫苗的研究进展 被引量：2
4
作者 李昀真 胡博 +4 位作者 李虹晔 许丽文 张成琪 代昕宇 白雪 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1567-1573,共7页
犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是引起的犬腹泻是导致犬类死亡的高度接触性传染病病原之一。针对这种疫病目前最为有效的防控方法就是疫苗接种,然而由于多种因素的影响如病毒变异、母源抗体干扰等因素导致的免疫后感染发生率仍然... 犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是引起的犬腹泻是导致犬类死亡的高度接触性传染病病原之一。针对这种疫病目前最为有效的防控方法就是疫苗接种,然而由于多种因素的影响如病毒变异、母源抗体干扰等因素导致的免疫后感染发生率仍然较高。目前已应用的传统疫苗如灭活疫苗或弱毒疫苗具有其不足之处,开发新型疫苗提高免疫效力是较为有效的防控措施。因此,现从细小病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程亚单位疫苗及核酸疫苗等角度介绍CPV疫苗的研究进展,为细小病毒防控产品的研制提供借鉴。 展开更多
关键词 犬细小病毒 新型疫苗 病毒样颗粒
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基于S蛋白的犬冠状病毒间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：1
5
作者 曹海旭 胡博 +7 位作者 李虹晔 李昀真 代昕宇 张成琪 李双双 张海玲 廉士珍 白雪 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期564-571,共8页
旨在原核表达犬冠状病毒(CCoV)的刺突(S)蛋白,以此为包被抗原,通过优化条件建立CCoV血清抗体间接ELISA检测方法。首先,将CCoV的S基因序列克隆至原核表达载体pColdⅠ中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。Western-blot验证蛋白大小约... 旨在原核表达犬冠状病毒(CCoV)的刺突(S)蛋白,以此为包被抗原,通过优化条件建立CCoV血清抗体间接ELISA检测方法。首先,将CCoV的S基因序列克隆至原核表达载体pColdⅠ中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。Western-blot验证蛋白大小约为28 ku,纯化后作为包被抗原,通过优化条件建立检测CCoV抗体的间接ELISA,抗原包被最佳质量浓度为4μg/mL;待检血清稀释度为1∶160时D_(450)最高;酶标抗体最佳稀释度为1∶3000;TMB最佳显色时间为20 min;最佳封闭液为50 g/L脱脂奶粉溶液;阴阳性临界值为D_(450)=0.214;与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒的阳性血清均不发生交叉反应,表明特异性好;批内变异系数最大值为4.531%,批间变异系数最大值为2.908%,表明重复性好;该方法能检测到640倍稀释的血清,表明敏感性较高。应用该方法对161份临床犬血清进行检测,发现阳性率为98.7%,说明CCoV的感染率较高。本研究为CCoV抗体检测提供了有效工具。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 S蛋白 原核表达 ELISA
原文传递
犬细小病毒颗粒疫苗的研制与免疫效果评价
6
作者 李昀真 代昕宇 +4 位作者 李双双 许丽文 张成琪 胡博 白雪 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2023年第12期1516-1522,共7页
犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(CPV)引起的一种高度传染性疾病,目前最为有效的防控方法为疫苗接种。本研究将CPV VP2基因克隆于pQB3载体中,将鉴定正确的pQB3-VP2重组质粒与qBac-ⅢG杆粒共转染至sf9昆虫细胞中,拯救获得表达CPV VP2蛋... 犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(CPV)引起的一种高度传染性疾病,目前最为有效的防控方法为疫苗接种。本研究将CPV VP2基因克隆于pQB3载体中,将鉴定正确的pQB3-VP2重组质粒与qBac-ⅢG杆粒共转染至sf9昆虫细胞中,拯救获得表达CPV VP2蛋白和绿色荧光蛋白的重组杆状病毒rBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞可出现明显的细胞病变,在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光,间接免疫荧光鉴定显示rBac-VP2感染的sf9细胞可见明显的红色荧光。对细胞表达的VP2蛋白进行Western-blot鉴定,结果显示在约65 ku处可见明显的目标蛋白条带,电镜下可见与天然细小病毒形态大小相似的粒子,表明rBac-VP2感染昆虫细胞后可组装形成病毒样颗粒(VLPs),收获的VLPs血凝效价可达1∶210。将CPV VLPs免疫小鼠后诱导机体产生血凝抑制抗体,效价达1∶27,与宠必威幼犬保商业化疫苗产生的免疫效果相当。本研究为犬细小病毒新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 犬细小病毒 新型疫苗 病毒样颗粒 杆状病毒
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