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人源性受磷蛋白稳定表达细胞系的构建
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作者 陈岚卿 王宇宁 +5 位作者 李典一 徐路遥 李廉杰 李泽浩 刘华 刘茜 《法医学杂志》 CAS CSCD 2021年第5期615-620,共6页
目的构建稳定表达人源性受磷蛋白(phospholamban,PLN)的细胞系,并初步探索其在心肌毒性机制研究中的应用。方法采用FastCloning方法将目的基因PLN的开放阅读框序列插入至真核表达载体pcDNA5/FRT/TO(以下简称pDFT),构建pDFT-PLN-Flag质粒... 目的构建稳定表达人源性受磷蛋白(phospholamban,PLN)的细胞系,并初步探索其在心肌毒性机制研究中的应用。方法采用FastCloning方法将目的基因PLN的开放阅读框序列插入至真核表达载体pcDNA5/FRT/TO(以下简称pDFT),构建pDFT-PLN-Flag质粒,并与pOG44质粒共转染Flp-In^(TM) T-REx^(TM) 293细胞,实现目的基因的表达,通过潮霉素B抗性持续压力筛选出重组成功的单克隆细胞株。应用West⁃ern印迹法和间接免疫荧光法检验重组细胞目的蛋白的表达情况。对构建成功的细胞系进行乌头碱染毒后,通过Western印迹法,检测PLN磷酸化的变化。结果重组质粒PCR扩增及DNA电泳后含有与已知PLN基因片段大小一致的扩增产物,测序后与人源性PLN基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列一致。间接免疫荧光法和Western印迹法提示构建的可增殖细胞系,诱导调控下可稳定且较高水平表达人源性PLN。乌头碱浓度为1μmol/L、染毒2 h时,PLN的Thr17位点磷酸化水平降低。结论该人源性细胞株可以稳定表达PLN,并可用于乌头碱在分子水平上对细胞影响机制的研究。 展开更多
关键词 法医病理学 法医毒理学 受磷蛋白 人源性细胞系 乌头碱 生物化学 分子生物学
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