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11种常见支原体环介导等温扩增检测方法的建立及验证
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作者 柯晓梅 吴宇曼 +5 位作者 孔伟圣 陈智妍 刘帅 吴华佐 朱霞燕 张健 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期980-986,共7页
目的 建立一种用于同时检测多种支原体污染的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法,并进行验证。方法 通过SnapGene软件的多序列比对工具比对13种支原体16S rRNA基因的保守序列,根据保守序列设计2条内引物FIP... 目的 建立一种用于同时检测多种支原体污染的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法,并进行验证。方法 通过SnapGene软件的多序列比对工具比对13种支原体16S rRNA基因的保守序列,根据保守序列设计2条内引物FIP和BIP、2条外引物F3和B3、环引物LOOP(LF/LB);建立LAMP体系:Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μL)、10×ThermoPoly反应缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L(H4)2SO4,2 mmol/L MgSO4,0.1%Triton X-100,pH 8.8]、MgSO4(100 mmol/L)、dNTP Mix、FIP/BIP Primers、F3/B3 Primers、LOOP Primers、无核酸酶水、模板DNA(13种搭载支原体16S rRNA的质粒)。产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。验证方法可行性、特异性、可重复性,确定方法检测限。结果 筛选的2组LAMP引物,组合使用可同时检测出11种支原体序列;在其他非特异模板检测中未出现非特异扩增,引物组特异性良好;建立的方法灵敏度好,最低检测限为30.1 copies/μL,且重复性好,未见假阳性和假阴性扩增。结论 LAMP技术可用于检测细胞培养中多种支原体污染的情况,特异性好、耗时短,可作为细胞培养中快速检测支原体污染的技术平台之一。 展开更多
关键词 环介导等温扩增 支原体 16S rRNA
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