目的:构建乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)重组腺病毒,为HBV的相关研究提供一种高效率、便捷的实验手段。方法:将HBV1.3倍体的片段构建到pAdTrack-TO4穿梭载体上,再经限制性核酸内切酶PmeⅠ线性化后转入含有腺病毒骨架载体pAd-Easy...目的:构建乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)重组腺病毒,为HBV的相关研究提供一种高效率、便捷的实验手段。方法:将HBV1.3倍体的片段构建到pAdTrack-TO4穿梭载体上,再经限制性核酸内切酶PmeⅠ线性化后转入含有腺病毒骨架载体pAd-Easy1的BJ5183感受态中进行重组并鉴定。鉴定正确后的重组腺病毒质粒经PacⅠ线性化后转染入HEK-293细胞进行病毒包装,获取HBV1.3倍体的重组腺病毒(Ad-HBV1.3)。通过荧光显微镜进行感染效率的检测;用ELISA、Western blot方法在蛋白水平检测HBV蛋白表达情况;小鼠尾静脉注射HBV1.3倍体的重组腺病毒,检测经腺病毒感染后的小鼠体内HBV表达情况。结果:在Ad-HBV1.3腺病毒感染后,细胞的感染效率可达到95%以上;ELISA实验检测实验组乙型肝炎s蛋白(hepatitis B virus S protein,HBs)、乙型肝炎e蛋白(hepatitis B virus E protein,HBe)表达量明显高于对照组;Western blot结果显示感染Ad-HBV1.3腺病毒后可有高水平的HBs表达;动物实验显示小鼠在注射Ad-HBV1.3腺病毒后体内HBs在第3天即可开始表达,5 d达到峰值,7 d后逐渐下降。结论:本研究成功构建了可表达HBV的重组腺病毒,其感染效率可高达95%,为HBV相关研究提供一种简单高效的研究手段。展开更多
目的:研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)对microRNA形成相关因子Pasha表达的调控,并对其作用机制进行初步探讨。方法:用RT-PCR,Western blot的方法检测HepG2细胞及稳定表达HBV的HepG2-H7细胞中Pasha的表达差异。构建Pasha启动子...目的:研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)对microRNA形成相关因子Pasha表达的调控,并对其作用机制进行初步探讨。方法:用RT-PCR,Western blot的方法检测HepG2细胞及稳定表达HBV的HepG2-H7细胞中Pasha的表达差异。构建Pasha启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒,分别转染HepG2细胞及HepG2-H7细胞,检测HBV对Pasha启动子的影响。将Pasha启动子质粒与HBV 4种蛋白的真核表达质粒共转染HepG2细胞,寻找对启动子影响较大的HBV蛋白。结果:RT-PCR和Western blot的结果显示Pasha在HepG2-H7细胞中的表达较HepG2细胞明显下降。萤火虫荧光素酶活性分析显示HBV能抑制Pasha启动子的活性,且HBx和HBs蛋白对其影响较大。结论:HBV蛋白可以通过抑制Pasha启动子活性调节其在HepG2-H7细胞中的表达。展开更多
目的探讨HBx（hepatitis B virus X protein）及HBs（hepatitis B virus S protein）对RhoC启动子的作用机制，分析可能相互作用的启动子调控元件。方法构建RhoC启动子截短突变克隆，双荧光素酶报告分析系统（the dual-luciferase repor...目的探讨HBx（hepatitis B virus X protein）及HBs（hepatitis B virus S protein）对RhoC启动子的作用机制，分析可能相互作用的启动子调控元件。方法构建RhoC启动子截短突变克隆，双荧光素酶报告分析系统（the dual-luciferase reporter assay system）检测RhoC启动子相对荧光素酶活性，通过分析启动子相对活性变化进而筛寻到起调控作用的启动子区段。过表达Ets-1转录因子，检测RhoC启动子相对荧光素酶活性。结果①成功构建了5个RhoC启动子截短变异克隆。②分别在HepG2细胞和HepG2.2．15细胞中验证了RhoC截短变异启动子活性，确定了起关键作用的启动子区段（-491bp～-320bp、-124bp～-58bp）。③HepG2细胞中分别过表达HBx及HBs，发现启动子区段-491bp～-320bp及-187bp～-124bp可以被HBx及HBs调控。④文献检索结合软件分析这些启动子区段序列，找到了高度相关的转录因子Ets-1、NF-κB、Sp1等。⑤荧光素酶检测和Real-time PCR初步验证了转录因子Ets-1对RhoC的调控作用。结论HBx及HBs可能通过Ets-1等转录因子调控RhoC启动子进而上调RhoC启动子活性。展开更多
文摘目的:构建乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)重组腺病毒,为HBV的相关研究提供一种高效率、便捷的实验手段。方法:将HBV1.3倍体的片段构建到pAdTrack-TO4穿梭载体上,再经限制性核酸内切酶PmeⅠ线性化后转入含有腺病毒骨架载体pAd-Easy1的BJ5183感受态中进行重组并鉴定。鉴定正确后的重组腺病毒质粒经PacⅠ线性化后转染入HEK-293细胞进行病毒包装,获取HBV1.3倍体的重组腺病毒(Ad-HBV1.3)。通过荧光显微镜进行感染效率的检测;用ELISA、Western blot方法在蛋白水平检测HBV蛋白表达情况;小鼠尾静脉注射HBV1.3倍体的重组腺病毒,检测经腺病毒感染后的小鼠体内HBV表达情况。结果:在Ad-HBV1.3腺病毒感染后,细胞的感染效率可达到95%以上;ELISA实验检测实验组乙型肝炎s蛋白(hepatitis B virus S protein,HBs)、乙型肝炎e蛋白(hepatitis B virus E protein,HBe)表达量明显高于对照组;Western blot结果显示感染Ad-HBV1.3腺病毒后可有高水平的HBs表达;动物实验显示小鼠在注射Ad-HBV1.3腺病毒后体内HBs在第3天即可开始表达,5 d达到峰值,7 d后逐渐下降。结论:本研究成功构建了可表达HBV的重组腺病毒,其感染效率可高达95%,为HBV相关研究提供一种简单高效的研究手段。
文摘目的探讨HBx（hepatitis B virus X protein）及HBs（hepatitis B virus S protein）对RhoC启动子的作用机制，分析可能相互作用的启动子调控元件。方法构建RhoC启动子截短突变克隆，双荧光素酶报告分析系统（the dual-luciferase reporter assay system）检测RhoC启动子相对荧光素酶活性，通过分析启动子相对活性变化进而筛寻到起调控作用的启动子区段。过表达Ets-1转录因子，检测RhoC启动子相对荧光素酶活性。结果①成功构建了5个RhoC启动子截短变异克隆。②分别在HepG2细胞和HepG2.2．15细胞中验证了RhoC截短变异启动子活性，确定了起关键作用的启动子区段（-491bp～-320bp、-124bp～-58bp）。③HepG2细胞中分别过表达HBx及HBs，发现启动子区段-491bp～-320bp及-187bp～-124bp可以被HBx及HBs调控。④文献检索结合软件分析这些启动子区段序列，找到了高度相关的转录因子Ets-1、NF-κB、Sp1等。⑤荧光素酶检测和Real-time PCR初步验证了转录因子Ets-1对RhoC的调控作用。结论HBx及HBs可能通过Ets-1等转录因子调控RhoC启动子进而上调RhoC启动子活性。
