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短间隔连续部分肝切除(SISPH)对肝细胞核和核仁的影响 被引量：6
1
作者 段瑞峰 昌静峰 +2 位作者 张冬芬 夏民 徐存拴 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第S1期199-206,共8页
以建立的 4种短间隔连续部分肝切除模型 (shortintervalsuccessivepartialhepatectomy ,SISPH)为材料 ,分析了连续部分肝切除 (successivepartialhepatectomy ,SPH)次数和方式对大鼠肝细胞核和核仁的体积、数目影响 ,证实了肝细胞核和... 以建立的 4种短间隔连续部分肝切除模型 (shortintervalsuccessivepartialhepatectomy ,SISPH)为材料 ,分析了连续部分肝切除 (successivepartialhepatectomy ,SPH)次数和方式对大鼠肝细胞核和核仁的体积、数目影响 ,证实了肝细胞核和核仁的大小、数目变化与SISPH的次数和方式正相关。 展开更多
关键词 大鼠 短间隔连续部分肝切除(SISPH) 细胞核 肝细胞核数 核仁组织区(NOR)
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短间隔连续部分肝切除(SISPH)中糖原、G-6-Pase和RNA变化分析 被引量：3
2
作者 夏民 段瑞峰 +2 位作者 昌静峰 张冬芬 徐存拴 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第S1期233-240,共8页
以 4种短间隔连续部分肝切除模型 (shortintervalsuccessivepartialhepatectomy ,SISPH)为材料 ,分析了连续部分肝切除 (succesivepartialhepatectomy ,SPH)次数和方式对肝糖原和RNA含量和分布及葡萄糖 6 磷酸酶 (G 6 Pase)活性和分布... 以 4种短间隔连续部分肝切除模型 (shortintervalsuccessivepartialhepatectomy ,SISPH)为材料 ,分析了连续部分肝切除 (succesivepartialhepatectomy ,SPH)次数和方式对肝糖原和RNA含量和分布及葡萄糖 6 磷酸酶 (G 6 Pase)活性和分布的影响 ,发现 :( 1)上述因素均可显著影响它们的活性或含量和分布 ;( 2 )肝糖原含量变化与G 6 Pase活性无显著相关性。 展开更多
关键词 大鼠 短间隔连续部分肝切除(SISPH) 肝再生 糖原 G-6-Pase RNA
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甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立 被引量：3
3
作者 王云龙 周春峰 +7 位作者 孙新城 李玉林 陈冬焕 李恒思 昌静峰 王国强 董彩文 刘旺根 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第8期37-41,共5页
建立甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法,通过优化IPTG浓度和诱导时间确定HA融合蛋白的最佳表达条件,并进行Western bloc和血凝试验鉴定。用纯化蛋白制备单克隆抗体,建立检测甲型H1N1流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法,对其交叉... 建立甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法,通过优化IPTG浓度和诱导时间确定HA融合蛋白的最佳表达条件,并进行Western bloc和血凝试验鉴定。用纯化蛋白制备单克隆抗体,建立检测甲型H1N1流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法,对其交叉反应、符合率进行验证。结果表明,HA蛋白在BL21(DE3)中得到表达,主要以包涵体的形式存在,分子质量为64 ku,最佳诱导条件为IPTG终浓度0.2 mmol/L,诱导时间4 h。Western blot鉴定其与H1N1病毒有相同的抗原性,血凝试验表明无血凝活性。制备HA单抗并初步建立双抗体夹心ELISA检测方法,检测100份阳性PCR样本,符合率为96%。建立的夹心ELISA方法可用于H1N1亚型流感病毒的初步诊断。 展开更多
关键词 血凝素 甲型H1N1流感病毒 原核表达 双抗体夹心ELISA
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人脂联素原核表达纯化及活性检测 被引量：3
4
作者 王云龙 李永超 +8 位作者 昌静峰 李玉林 王国强 邓黎黎 陈冬焕 董彩文 孙新城 刘旺根 梁晓艳 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第10期36-39,共4页
为了克隆人脂联素基因(ACRP30),获得有免疫活性的重组人脂联素,以人皮下脂肪组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到ACRP30基因。构建重组质粒pET-CKS-ACRP30,转化表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达人脂联素重组蛋白,利用镍亲和层析纯化,Wes... 为了克隆人脂联素基因(ACRP30),获得有免疫活性的重组人脂联素,以人皮下脂肪组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到ACRP30基因。构建重组质粒pET-CKS-ACRP30,转化表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达人脂联素重组蛋白,利用镍亲和层析纯化,Western blot鉴定其活性,双抗体夹心法检测其免疫活性。获得了人脂联素基因,表达纯化了人脂联素融合蛋白,融合蛋白分子质量约为50ku,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯度达到90%,双抗体夹心法检测重组蛋白具有免疫活性。本研究成功表达了人脂联素重组蛋白且表达产物具有免疫活性,为人脂联素检测技术的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 人脂联素 原核表达 免疫活性
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O型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立 被引量：3
5
作者 王云龙 孙强 +6 位作者 昌静峰 李玉林 王国强 董彩文 刘旺根 梁晓艳 孙新城 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第5期31-35,共5页
表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白,用于O型口蹄疫病毒的检测。以质粒T234/FMDV为模板,PCR扩增VP1基因片段,构建重组质粒pET-41b/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot进行分析检测,目的蛋白经镍离子亲和层析纯化,... 表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白,用于O型口蹄疫病毒的检测。以质粒T234/FMDV为模板,PCR扩增VP1基因片段,构建重组质粒pET-41b/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot进行分析检测,目的蛋白经镍离子亲和层析纯化,以纯化的目的蛋白包被,建立了间接VP1-ELISA检测方法。VP1基因表达的蛋白主要以包涵体形式存在,复性后具有免疫反应性,方阵滴定法确定了包被抗原的最佳工作浓度(1 mg/L),最佳的酶结合稀释度为1∶8 000,检测结果特异性好。O型口蹄疫病毒VP1基因可在表达载体pET-41b中表达,并建立了O型口蹄疫病毒检测方法。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 原核表达 间接ELISA
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肠道病毒71型VP1基因的表达纯化及初步应用 被引量：1
6
作者 王云龙 刘元帅 +8 位作者 董彩文 孙新城 李玉林 刘旺根 昌静峰 王国强 张曼莉 王继创 秦贵军 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第14期1849-1851,共3页
目的表达纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法。方法通过化学法合成肠道病毒71型VP1全基因序列,构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21(DE)3,IPTG诱导表达,镍金属亲和层析纯化目的蛋白... 目的表达纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法。方法通过化学法合成肠道病毒71型VP1全基因序列,构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21(DE)3,IPTG诱导表达,镍金属亲和层析纯化目的蛋白,产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。以目的蛋白作为包被抗原,初步建立间接ELISA检测方法,并对77份6～10岁无手足口病症状儿童血清及手足口病现症患儿血清进行检测。结果成功构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,VP1融合蛋白分子量约为43 kD,纯度可达95%;初步建立了人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法,36例HFMD现症患儿中EV71 IgG阳性22例(61.11%);41例无手足口症状儿童血清中EV71 IgG阳性21例(51.22%)。结论表达产物具有较好的免疫原性,可用于肠道病毒71抗体检测。 展开更多
关键词 肠道病毒71 VP1 表达 纯化 间接ELISA
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甲型(H1N1)(2009)流感病毒三重RT-PCR快速检测方法的建立 被引量：2
7
作者 王云龙 李彦霞 +4 位作者 李智涛 王国强 昌静峰 孙新城 徐桂超 《山东医药》 CAS 北大核心 2010年第32期22-24,共3页
目的建立一种早期快速检测甲型(H1N1)(2009)流感流行病毒株的方法。方法将2009年分离的甲型(H1N1)流感流行病毒株基因与以前的流感病毒株进行序列比对,找出其特异的基因序列,设计针对甲型(H1N1)(2009)流行株的血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA... 目的建立一种早期快速检测甲型(H1N1)(2009)流感流行病毒株的方法。方法将2009年分离的甲型(H1N1)流感流行病毒株基因与以前的流感病毒株进行序列比对,找出其特异的基因序列,设计针对甲型(H1N1)(2009)流行株的血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)基因的三对特异引物,采用RT-PCR同时扩增三条目的片段,通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果此方法对临床标本的阳性检出率为71%。结论采用三重PCR同时扩增甲型(H1N1)(2009)流感流行病毒的三段特异序列既缩短检测时间又提高了检测特异性,无交叉反应,是一种有效可行的快速检测甲型(H1N1)(2009)流感流行病毒株的方法。 展开更多
关键词 流感病毒A型 三重RT-PCR 实验室技术和方法
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甲型流感病毒NP蛋白原核表达及其金标检测方法的建立 被引量：1
8
作者 王云龙 贾丽锋 +3 位作者 曹刚强 李玉林 李恒思 昌静峰 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第10期19-23,共5页
构建甲型流感病毒NP基因重组质粒,制备NP蛋白,建立甲型流感病毒胶体金检测方法。设计引物,扩增人工合成的甲型流感病毒株A(H5 N1)(GenBank登录号AY585439)NP DNA基因,构建pET-30 Xa/LIC-NP重组质粒,转化入原核表达系统E.coliBL21 Gold... 构建甲型流感病毒NP基因重组质粒,制备NP蛋白,建立甲型流感病毒胶体金检测方法。设计引物,扩增人工合成的甲型流感病毒株A(H5 N1)(GenBank登录号AY585439)NP DNA基因,构建pET-30 Xa/LIC-NP重组质粒,转化入原核表达系统E.coliBL21 Gold中进行表达和纯化。结果制备了纯度高达900 mL/L的甲型流感病毒NP融合蛋白,并初步建立了金标检测方法。 展开更多
关键词 甲型流感病毒 原核表达 NP蛋白 胶体金检测
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含A(H1N1)流感病毒NP基因病毒样颗粒的构建和表达
9
作者 王云龙 徐桂超 +4 位作者 李智涛 孙新城 王国强 昌静峰 李彦霞 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2010年第17期3083-3086,共4页
目的:构建并表达含有A(H1N1)流感病毒NP基因片段并可抗RNase降解的病毒样颗粒,作为RT-PCR检测的阳性对照。方法:设计带有NcoⅠ、BamHⅠ酶切位点的引物克隆MS2噬菌体的装配蛋白和包膜蛋白基因,化学合成含BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的A(H1N1... 目的:构建并表达含有A(H1N1)流感病毒NP基因片段并可抗RNase降解的病毒样颗粒,作为RT-PCR检测的阳性对照。方法:设计带有NcoⅠ、BamHⅠ酶切位点的引物克隆MS2噬菌体的装配蛋白和包膜蛋白基因,化学合成含BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的A(H1N1)流感病毒NP基因片段,将这些基因连接到质粒载体pET-28b(+)上,转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中进行表达,表达产物进行纯化,然后进行RNase攻击试验和稳定性试验。结果:获得含NP基因片段的病毒样颗粒,可抵抗RNase降解,并能在37℃稳定保存30d。结论:该病毒颗粒稳定、安全、可靠,可作为A(H1N1)流感病毒RT-PCR检测、定量分析的有效阳性参考品。 展开更多
关键词 流感病毒A型 H1N1亚型 RT-PCR 阳性对照 病毒样颗粒 核糖核酸酶
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RNAi技术干扰人喉癌Hep-2细胞PTTG1基因的初步研究
10
作者 王云龙 孙新城 +5 位作者 徐桂超 昌静峰 李玉林 王国强 刘旺根 董彩文 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2011年第16期2913-2917,共5页
目的:探索对人PTTG1基因mRNA序列有较高干扰效率的位点,构建对PTTG1基因的表达有较高抑制效率的重组质粒。方法:筛选、合成1对互补DNA单链,退火为双链后与双酶切后的质粒载体连接,构建了表达短发夹RNA的1种重组质粒plk0.1-puro/PTTG1。... 目的:探索对人PTTG1基因mRNA序列有较高干扰效率的位点,构建对PTTG1基因的表达有较高抑制效率的重组质粒。方法:筛选、合成1对互补DNA单链,退火为双链后与双酶切后的质粒载体连接,构建了表达短发夹RNA的1种重组质粒plk0.1-puro/PTTG1。重组质粒以不同浓度转染,并于转染后不同时间收集细胞,以β-actin为内参,采用RT-PCR和Western blot技术分别检测PTTG1基因的mRNA、蛋白质的相对表达水平。结果:与空白对照组相比,6孔板中每孔转染质粒plk0.1-puro/PTTG 11000ng以上、转染超过12d时,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平下降70%以上。结论:重组质粒plk0.1-puro/PTTG1,在6孔细胞培养板中以1000ng/孔转染12d以上时,有效抑制了人PTTG1基因的表达,在关于PTTG1基因的研究中具有较好的应用价值。 展开更多
关键词 RNAI PTTG1基因 SHRNA
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