340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位点耐药相关突变分析 被引量：36

1

作者 徐东平 刘妍 +9 位作者 成军 李晓东 戴久增 李乐 梁兆玲 白丽 钟彦伟 许智慧 任晓强 张玲霞 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期735-738,共4页

目的分析慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因与核苷（酸）类似物耐药相关的12个位点上的突变情况及其临床意义。方法提取血清HBVDNA，扩增HBV逆转录酶基因，对PCR产物进行DNA双向测序，对测序成功的样本进行基因型分析。检测逆转录酶基因1... 目的分析慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因与核苷（酸）类似物耐药相关的12个位点上的突变情况及其临床意义。方法提取血清HBVDNA，扩增HBV逆转录酶基因，对PCR产物进行DNA双向测序，对测序成功的样本进行基因型分析。检测逆转录酶基因12个位点上的碱基突变情况，分析不同核苷（酸）．类似物使用情况、患者的耐药相关突变情况及不同核苷（酸）类似物耐药的突变形式。结果检出拉米夫定耐药突变63例，阿德福韦耐药突变10例，恩替卡韦耐药突变8例，替比夫定耐药突变l例。拉米夫定耐药突变中以M204V和M204I最常见，前者通常伴随L180M突变，后者常单独出现；阿德福韦耐药中以N236T±A181位碱基替换为主；恩替卡韦耐药突变发生在拉米夫定耐药基础上，以T184位碱基替换为主；替比夫定的耐药突变为M204I。少数未接受过核苷（酸）类似物治疗的患者也可检出耐药相关突变。结论检测HBV逆转录酶基因多位点耐药相关突变，有助于临床及时发现和确认乙型肝炎患者是否存在HBV耐药，合理进行抗病毒治疗。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 突变 耐药

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慢性HBV感染患者恩替卡韦基因型耐药突变特征分析 被引量：15

2

作者 刘妍 李庆虹 +6 位作者 李乐 施建飞 纪冬 白文林 姚增涛 戴久增 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期621-624,628,共5页

目的分析经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者反转录酶(RT)区恩替卡韦(ETV)基因型耐药突变特征及其临床意义。方法提取3800例慢性HBV感染患者血清中的HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBVRT基因,PCR产物直接测序检测RT突变,... 目的分析经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者反转录酶(RT)区恩替卡韦(ETV)基因型耐药突变特征及其临床意义。方法提取3800例慢性HBV感染患者血清中的HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBVRT基因,PCR产物直接测序检测RT突变,分析与ETV耐药相关突变的形式及其临床意义。结果 3800例慢性HBV感染患者中,128例(3.4%)检出38种ETV基因型耐药突变,以rtT184位点替换突变最常见(79/128,61.7%),包括7例rtT184/rtS202G位点同时突变。共有5种替代突变形式rtT184L/I/A/S/F,其中rtT184L(29/30)、rtT184A(7/7)和rtT184S(10/12)均伴随rtL180M+rtM204V突变,而rtT184I多伴随rtM204I突变(7/8)。rtS202位点突变33例(25.8%),全部为rtS202G,包括7例rtT184/rtS202G位点同时突变,多伴随rtL180M+rtM204V突变。rtM250位点突变23例(18.0%),其中rtM250L(15/17)常伴随rtM204I突变,而rtM250V均伴随rtL180M+rtM204V突变(5/5)。仅6例(4.7%)检出rtI169T突变并均伴有rtT184位点的突变。还检出同时含有ETV及阿德福韦(ADV)耐药位点的多药耐药突变3例。ETV耐药突变多出现在拉米夫定(LAM)和ETV经治的患者(96/128,75.0%),其中以LAM→ADV→ETV(42例)和LAM→ETV(28例)为主;还出现在LAM经治而未用过ETV治疗的患者(27/128,21.1%),其中以LAM单一治疗(10例)和LAM→ADV(9例)为主。结论慢性HBV感染患者抗病毒治疗中出现的ETV耐药突变多见于单药序贯治疗,突变形式以rtL180M+rtM204V+rtT184L或rtS202G为主,而rtI169T突变在ETV耐药中不起重要作用。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 恩替卡韦 基因型 突变

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核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎患者HBV基因耐药变异影响因素分析 被引量：15

3

作者 赵攀 戴久增 +4 位作者 柳芳芳 姚增涛 李乐 辛绍杰 徐东平 《传染病信息》 2013年第2期93-95,130,共4页

目的研究核苷(酸)类似物抗HBV治疗中病毒聚合酶基因区耐药突变的相关因素。方法从我院行HBV聚合酶基因区序列测定的患者中,选择持续单一或联合应用核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎(乙肝)和乙肝肝硬化患者,分析其宿主、病毒和药物等对... 目的研究核苷(酸)类似物抗HBV治疗中病毒聚合酶基因区耐药突变的相关因素。方法从我院行HBV聚合酶基因区序列测定的患者中,选择持续单一或联合应用核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎(乙肝)和乙肝肝硬化患者,分析其宿主、病毒和药物等对HBV基因耐药变异的影响,包括性别、年龄、诊断、HBV基因型、HBeAg、HBVDNA水平、ALT、AST、TBIL及药物(包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、拉米夫定┼阿德福韦酯联合治疗)。结果分析结果显示,年龄、血清HBVDNA水平、HBeAg(-)和核苷(酸)类似物种类是影响病毒聚合酶基因区突变的相关因素。结论年龄>40岁且HBeAg(-)的血清高病毒载量的慢性乙肝患者,在临床上病毒耐药发生率较高。对于核苷(酸)初治的慢性乙肝患者,恩替卡韦单药治疗与拉米夫定┼阿德福韦酯联合治疗耐药发生率相似,显著低于拉米夫定单药和阿德福韦酯单药治疗。 展开更多

关键词 核苷类 肝炎 乙型 慢性 突变

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隐匿性乙型肝炎病毒感染患者S基因突变特点分析 被引量：14

4

作者 陈建宏 刘妍 +7 位作者 许智慧 思兰兰 戴久增 李奇 王帅 李进 韩聚强 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期178-183,共6页

目的分析1例血清HBV DNA长期阳性但HBsAg阴性的隐匿性乙型肝类病毒感染(OBI)患者HBV S基因突变特点,揭示S基因突变与OBI发生及肝脏疾病进展的关系。方法收集该患者不同时间点的4份血清样本,扩增HBV S基因并进行克隆测序,挑选代表性突变... 目的分析1例血清HBV DNA长期阳性但HBsAg阴性的隐匿性乙型肝类病毒感染(OBI)患者HBV S基因突变特点,揭示S基因突变与OBI发生及肝脏疾病进展的关系。方法收集该患者不同时间点的4份血清样本,扩增HBV S基因并进行克隆测序,挑选代表性突变株病毒基因构建重组载体并进行表型分析。结果从该患者4份血清样本中检出多种S基因突变形式,包括前S1区大片段缺失、s126–127"RPCMNCTI"插入突变、sQ129N、s131–133 TSM→NST和经典的sG145R突变等,其中s131–133 TSM→NST在前后4份动态样本的检测病毒克隆中所占比例分别为0%、26%、59%和74%;前S1区大片段缺失在4份样本检测病毒克隆中始终存在,所占比例分别为26%、17%、15%和21%。表型分析发现,sQ129N和s131–133 TSM→NST可以降低抗体对HBsAg的亲和力,增加病毒分泌;与野生株相比,前S1区大片段(nt 3046–3177)缺失病毒株复制力下降了43.7%,表面抗原启动子Ⅱ(SPⅡ)活性下降了97.2%;sG145R可降低病毒的分泌能力。结论此例HBV感染患者的长期OBI临床表现是由于其感染有多种S基因突变病毒株引起,其中一些S基因突变可以影响病毒的表型特点,可能与肝脏疾病进展密切相关。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 突变 肝炎表面抗原 乙型

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乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究 被引量：8

5

作者 刘妍 张亮 +3 位作者 戴久增 王琳 赵建晴 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期92-95,共4页

目的检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台。方法分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本H... 目的检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台。方法分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析。用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0。选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证。结果HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调。miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致。结论肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 微RNAS 基因表达

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华北地区HBV基因亚型特点及其与核苷(酸)类抗HBV药物耐药突变的关系 被引量：11

6

作者 李晓东 李庆虹 +7 位作者 李进 周渝霞 郝玉清 戴久增 李乐 姚增涛 张玲霞 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期629-631,634,共4页

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基因亚型在中国华北地区的分布情况及其对核苷(酸)类药物基因型耐药突变发生率的影响。方法提取2377例慢性乙肝(1942例)和乙肝相关肝硬化(435例)患者血清HBVDNA,采用巢式PCR扩增反转录酶(RT)基因区,对PCR产物... 目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基因亚型在中国华北地区的分布情况及其对核苷(酸)类药物基因型耐药突变发生率的影响。方法提取2377例慢性乙肝(1942例)和乙肝相关肝硬化(435例)患者血清HBVDNA,采用巢式PCR扩增反转录酶(RT)基因区,对PCR产物直接测序,根据所测RT/S基因序列构建系统进化树确定HBV基因亚型,检测RT区耐药突变,将数据录入HBVdb数据库进行分析。结果感染HBV各基因亚型的例数为B1型10例(0.4%),B2型344例(14.5%),B3型6例(0.3%),B4型8例(0.3%),C1型28例(1.2%),C2型1937例(81.4%),C3型21例(0.9%),C4型6例(0.3%),D型17例(0.7%)。B2和C2亚型患者之间在性别、HBVDNA载量、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶(ALT/AST)水平、胆碱酯酶、凝血酶原活动度方面差异无统计学意义(P>0.05);慢性乙肝患者中,C2亚型病毒感染的拉米夫定耐药突变V173L、L180M、M204I和阿德福韦酯耐药突变A181V检出率显著高于B2亚型病毒感染(P<0.05);乙肝相关肝硬化患者中,B2亚型病毒感染的阿德福韦酯耐药突变N236T检出率显著高于C2亚型病毒感染(P=0.014)。结论我国华北地区流行的HBV以C型和B型为主,其中C2和B2为主要亚型,HBV基因亚型可能会影响临床核苷(酸)类药物的耐药突变发生率。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 基因亚型 抗药性 病毒 突变

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阿德福韦酯治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析 被引量：9

7

作者 王晓 刘妍 +8 位作者 思兰兰 陈丽 白文林 刘立明 王嫣 许智慧 戴久增 姚增涛 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期256-259,共4页

目的鉴定1例阿德福韦酯(ADV)治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtN236V,并分析其表型耐药特点。方法从1例ADV治疗失败患者的血清中提取HBV DNA,采用巢式PCR扩增HBV RT区,将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体,转化JM109细... 目的鉴定1例阿德福韦酯(ADV)治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtN236V,并分析其表型耐药特点。方法从1例ADV治疗失败患者的血清中提取HBV DNA,采用巢式PCR扩增HBV RT区,将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体,转化JM109细胞。挑选34个阳性克隆进行DNA测序并分析耐药相关突变。构建1.1倍HBV野生株和耐药株重组载体,转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后分别加入不同浓度的拉米夫定(LAM)、ADV、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF),转染后第4天收集细胞培养液,采用实时荧光定量PCR法检测不同药物浓度作用下细胞培养上清中HBV DNA的产量,并分析其表型耐药特点。结果该例患者在接受ADV治疗15个月后出现病毒学突破和生化学突破,测序结果显示34个克隆中,20个(58.8%)为rtN236V变异株,11个(32.4%)为rtN236T变异株,2个(5.9%)为野生株,1个(2.9%)为rtA181V+N236V变异株。rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V变异株的相对病毒复制力分别为野生株的89.43%、83.60%和75.44%。表型耐药分析显示:rtN236T株、rtN236V株和rtA181V+N236V株对ADV的敏感性分别为野生株的1/4.75、1/3.10和1/5.10,但对LAM、ETV和TDF均敏感。结论在ADV长期治疗失败的慢性乙型肝炎患者血清病毒池中鉴定了新的变异形式rtN236V,并与rtN236T和rtA181V株伴随存在,该变异降低了病毒的复制力及对ADV的敏感性,可能是一个新的ADV耐药相关变异。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 变异 抗药性 病毒

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1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析(英文) 被引量：11

8

作者 刘妍 王春梅 +7 位作者 纪冬 徐辰 韩萍 任晓强 许智慧 戴久增 张玲霞 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期659-662,共4页

目的分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义。方法提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相... 目的分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义。方法提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析。结果检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例。多药耐药5例。LAM耐药突变中以M204V和M204I最常见,前者通常伴随L180 M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M204I。结论用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗。 展开更多

关键词 肝炎 乙型 慢性 突变 抗药性 病毒

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各种恩替卡韦耐药HBV株鉴定及替诺福韦酯对其抑制力分析 被引量：7

9

作者 李艳乐 刘妍 +8 位作者 许智慧 王晓 陈丽 戴久增 姚增涛 江玲 张连峰 徐东平 炎研究室 《传染病信息》 2013年第2期96-99,107,共5页

目的分析临床分离的不同形式恩替卡韦(ETV)耐药HBV株的病毒复制力并探讨替诺福韦酯(TDF)对其的抑制力。方法从4例ETV治疗失败的慢性乙型肝炎患者血清中提取并扩增HBV反转录酶(reverse transcriptase,RT)基因,克隆测序分析其基因型耐药... 目的分析临床分离的不同形式恩替卡韦(ETV)耐药HBV株的病毒复制力并探讨替诺福韦酯(TDF)对其的抑制力。方法从4例ETV治疗失败的慢性乙型肝炎患者血清中提取并扩增HBV反转录酶(reverse transcriptase,RT)基因,克隆测序分析其基因型耐药变异特点。选取代表性野生型和ETV耐药型HBV克隆株,构建pTriEx-HBV(C)1.1倍重组表达载体。提纯质粒转染HepG2细胞系,5d后检测上清中HBVDNA产生量,分析不同变异形式ETV耐药变异株体外复制力水平及TDF对其抑制力。结果 4份血清中共得到16种含不同HBVRT区变异形式的克隆株,10种与ETV耐药有关,另有6种与拉米夫定耐药有关。表型分析显示:与野生株相比,ETV耐药变异株复制力水平均有所下降,其中rtT184I+M204I变异株复制力最低,是野生株的19.3%,rtM204I+M250L基础上出现补偿突变(rtL80I、rtV173L和rtL180M)的变异株复制力较高,存在相同补偿突变的前提下,rtM204I基础上的耐药变异较rtM204V基础上的复制力低。TDF对各种类型ETV耐药变异病毒的复制力均有较强抑制作用(96.11%～99.90%)。结论与野生株相比,不同变异形式的ETV耐药变异株体外复制力均下降,TDF可有效抑制ETV耐药变异株复制,将是治疗ETV耐药患者的一种很好的选择。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒 突变 抗病毒药 抗药性

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丙型肝炎病毒非结构蛋白4A与钙离子信号调节亲环素配体的相互作用 被引量：7

10

作者 程勇前 成军 +6 位作者 王琳 刘妍 徐东平 钟彦伟 曲建慧 戴久增 李晓东 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期72-76,共5页

目的应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀技术证实HCV非结构蛋白4A(HCV NS4A)与钙离子信号调节亲环素配体(CAML)的相互作用。方法对CAML编码基因进行克隆,并构建其酵母表达载体.在酵母细胞中与HCV NS4A进行回交验证后,构建HCV NS4A及CAML真... 目的应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀技术证实HCV非结构蛋白4A(HCV NS4A)与钙离子信号调节亲环素配体(CAML)的相互作用。方法对CAML编码基因进行克隆,并构建其酵母表达载体.在酵母细胞中与HCV NS4A进行回交验证后,构建HCV NS4A及CAML真核表达载体,转染293细胞,行免疫共沉淀实验及Western印迹检测。结果成功克隆CAML基因,并构建CAML的酵母表达载体,在酵母细胞中回交验证HCV NS4A与CAML的相互作用,构建HCV NS4A及CAML的真核细胞表达载体,并利用免疫共沉淀技术验证了两者的相互作用。结论CAML与HCV NS4A的相互作用可能对HCV感染细胞的钙离子浓度、细胞凋亡等生物过程产生影响,从而在HCV感染慢性化过程中发挥作用。 展开更多

关键词 肝炎病毒 非结构蛋白类 钙信号 信号传导 亲环素类配体 酵母菌 杂交 免疫沉淀法

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乙型肝炎病毒X蛋白转录抑制抑癌基因p53表达的研究 被引量：6

11

作者 李进 刘妍 +2 位作者 戴久增 徐东平 张玲霞 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期26-29,共4页

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对抑癌基因p53基因表达的调节作用。方法以寡核苷酸芯片技术筛选的HBx反式调节基因结果为基础,利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域(p53p),构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p;以该质粒单独... 目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对抑癌基因p53基因表达的调节作用。方法以寡核苷酸芯片技术筛选的HBx反式调节基因结果为基础,利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域(p53p),构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p;以该质粒单独及与pcDNA3·1(-)-X共转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。进一步采用半定量RT-PCR技术检测HBVX蛋白对p53基因表达的调节。结果成功构建报告载体pCAT3-p53p,克隆的p53启动子有顺式激活下游基因的活性;pCAT3-p53p与pcDNA3·1(-)-X共转染时CAT的表达活性明显下降,说明HBV X蛋白抑制p53基因启动子的转录。RT-PCR结果表明,转染了pcDNA3·1(-)-X的HepG2细胞中p53基因mRNA表达减少。结论HBVX蛋白在转录水平上反式抑制抑癌基因p53的表达,本实验不仅验证了基因芯片的筛选结果,而且为HBx在致肝细胞癌发生中的作用提供分子基础。 展开更多

关键词 肝炎 病毒性 人 肝炎 乙型 蛋白P53 反式抑制

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乙型肝炎病毒发生rtA181T突变的临床特点与意义分析 被引量：9

12

作者 李晓东 蒋丽红 +6 位作者 李梵 刘妍 戴久增 赵攀 秦雅群 李进 徐东平 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期23-27,共5页

目的 乙型肝炎病毒逆转录酶（RT）区rtA181T突变与耐药相关,并可导致sW172终止突变,本研究旨在通过大样本测序与分析,明确rtA181T突变的发生特点与临床意义. 方法 研究对象为3 013例在解放军三○二医院就诊的慢性乙型肝炎患者,采集血清... 目的 乙型肝炎病毒逆转录酶（RT）区rtA181T突变与耐药相关,并可导致sW172终止突变,本研究旨在通过大样本测序与分析,明确rtA181T突变的发生特点与临床意义. 方法 研究对象为3 013例在解放军三○二医院就诊的慢性乙型肝炎患者,采集血清提取DNA,用PCR直接测序法检测耐药相关突变和病毒基因分型.构建rtA181T/sW172＊突变与野生株重组质粒分别转染HepG2细胞,比较培养上清液中HBsAg水平.HBsAg、HBV DNA水平的组间比较采用Wilcoxon秩和检验,HBV基因型构成比较采用x^2检验.结果 rtA181T的检出率为5.5％ （165/3013）,检出患者中大多数有拉米夫定和（或）阿德福韦酯用药史.突变类型上,40.0％ （66/165）为rtA181T单点突变,46.1％ （79/165）伴随阿德福韦酯耐药突变rtA181V/N236T,12.1％ （20/165）伴随拉米夫定耐药突变rtM204V/rtM204I,1.8％（3/165）伴随多重耐药突变;总体上73.9％ （122/165）在rt181位点可同时检出野生序列峰型.发生和未发生rtA181T突变的C/B基因型分别是92.1％/7.9％和82.1％/17.9％（P＜0.01）.对S蛋白影响上,98.2％ （162/165）引起sW172终止突变,1.8％（3/165）引起sW172L或sW 172S突变.体外实验中rtA181T/sW172＊突变株的HBsAg分泌受到抑制,但临床分析结果显示,检出rtA181T与未检出该突变的患者间血清HBV DNA和HBsAg水平差异无统计学意义（P＞ 0.05）. 结论 rtA181T突变与阿德福韦酯和拉米夫定用药史密切相关,可引起sW172终止突变抑制HBsAg分泌,但在患者中rt181突变株常与rt181非突变株共存,临床大样本分析结果表明单独出现该突变未对HBsAg和HBV DNA水平有明显影响. 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 突变 抗药性

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血清病毒检出核苷(酸)类似物耐药突变的慢性乙肝患者PBMCs中HBV cccDNA基因突变特点分析 被引量：6

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作者 李忠斌 任晓强 +7 位作者 刘妍 许智慧 李韦杰 戴久增 李乐 邵清 陈国凤 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期556-560,共5页

目的分析经核苷(酸)类似物治疗并已在血清病毒中产生耐药基因突变的慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)反转录酶(RT)区的基因突变特点。方法收集2010年7月-2011年8月于解放军302医院住院的慢性乙肝患者30... 目的分析经核苷(酸)类似物治疗并已在血清病毒中产生耐药基因突变的慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)反转录酶(RT)区的基因突变特点。方法收集2010年7月-2011年8月于解放军302医院住院的慢性乙肝患者30例,均经6个月以上的核苷(酸)类似物抗病毒治疗并已在血清中检测到耐药相关突变。采集与血清检测同一时间点的全血标本30份并分离PBMCs,提取总DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法扩增HBV cccDNA的RT区,分析9个位点的核苷(酸)类似物耐药相关变异。结果 30份样本中,16例检出HBV cccDNA,检出率为53.3%,PBMCs中HBV cccDNA检出率与HBeAg阳性率、血清ALT水平及血清HBVDNA载量均无显著相关性。在16例HBV cccDNA检出者中,B基因型5例,占31.3%,C基因型11例,占68.8%,与血清HBV基因分型结果一致。但是,与血清HBV均检出耐药突变株不同,16例PBMCs cccDNA中检出的病毒均是无核苷(酸)类似物耐药相关突变的野生株。结论在经核苷(酸)类似物治疗的慢性乙肝患者血清中HBV DNA产生耐药突变的情况下,PBMCs中HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,推测PBMCs可能是体内HBV野生株的"存储库"。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 DNA 环状 核苷(酸)类 突变

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拉米夫定和阿德福韦酯双重耐药HBV株临床检出特点与表型特性分析 被引量：5

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作者 陈容娟 刘妍 +8 位作者 李晓东 杜凤霞 思兰兰 李乐 许智慧 姚增涛 戴久增 徐东平 段昌柱 《传染病信息》 2018年第3期215-219,共5页

目的分析拉米夫定(lamivudine,LAM)和阿德福韦酯(adefovir,ADV)双重耐药HBV株临床检出特点和表型特性,为临床优化抗病毒方案提供参考。方法回顾性分析26 553例慢性HBV感染者血清样本中HBV反转录酶区与LAM和ADV耐药相关的突变类型及频率... 目的分析拉米夫定(lamivudine,LAM)和阿德福韦酯(adefovir,ADV)双重耐药HBV株临床检出特点和表型特性,为临床优化抗病毒方案提供参考。方法回顾性分析26 553例慢性HBV感染者血清样本中HBV反转录酶区与LAM和ADV耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对双重耐药HBV株进行鉴定,采用表型耐药方法分析强效核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]对双重耐药HBV的抑制效果。结果 26 553例慢性HBV感染者的血清样本中,LAM/ADV双重耐药HBV突变株的检出率为0.6%(147/26 553),主要突变类型为rt L180M+A181V+M204V(65.3%)和rt A181V+M204I(10.2%)。多数患者经历了LAM→ADV(40.8%)或LAM→ADV→ETV(38.8%)单药序贯/联合治疗,平均抗病毒时间为63个月。其中2例代表性LAM和ADV双重耐药患者的动态血清样本克隆结果显示,在恩替卡韦(entecavir,ETV)+ADV联合挽救治疗期间,随着获得完全病毒学应答后维持时间的延长,病毒准种池中LAM/ADV双重耐药株逐渐消失,病毒株以单一NAs耐药株或野生株为主。体外表型结果显示,各种双重耐药HBV突变株的体外复制力均低于野生株,ETV+ADV联合、替诺福韦酯(tenofovir,TDF)单独或TDF+ETV联合可有效抑制野生株复制(抑制率为98.5%~99.5%),而对各种LAM/ADV双重耐药突变株的抑制率分别为80.6%~92.5%、86.1%~97.9%和89.2%~97.5%。结论长期LAM和ADV单一序贯治疗可促进LAM/ADV双重耐药HBV发生,ETV+ADV联合、TDF单独或TDF+ETV联合均可有效抑制LAM/ADV双重耐药HBV复制,而基于TDF的挽救治疗效果更佳。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒 双重耐药突变 挽救治疗 抑制作用

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1740例慢性乙型肝炎患者替诺福韦酯耐药可能相关突变分析 被引量：5

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作者 梁兆玲 刘妍 +6 位作者 苏何玲 孟玉华 罗莉蓉 王静 戴久增 姚增涛 徐东平 《传染病信息》 2009年第4期207-210,共4页

目的通过大样本测序分析慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV反转录酶(reverse transcriptase,RT)序列,明确与替诺福韦酯(TDF)耐药可能相关的突变在我国患者未使用该药前的检出状况,预测TDF在我国临床的应用前景。方法收集1740例CHB患者血清,提取... 目的通过大样本测序分析慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV反转录酶(reverse transcriptase,RT)序列,明确与替诺福韦酯(TDF)耐药可能相关的突变在我国患者未使用该药前的检出状况,预测TDF在我国临床的应用前景。方法收集1740例CHB患者血清,提取血清中HBVDNA,采用巢式PCR方法扩增HBVRT基因,对PCR产物进行DNA测序,NTI软件比对结果。检测与核苷(酸)类似物耐药相关的RT区12个位点序列,重点分析了与TDF临床耐药可能相关的A194T突变以及体外证实可降低TDF活性的V214A、Q215S和A181V+N236T突变。结果540例(31%)患者分别检出了与拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替比夫定(LdT)耐药相关突变;未检出A194T突变;34例(2.0%)患者检出V214A突变;3例(0.2%)检出Q215S突变;15例(0.9%)检出A181V+N236T(其中3例为A181V/T+N236T)突变。结论未检出与TDF临床耐药可能相关的A194T突变,提示目前我国CHB患者自然发生或应用核苷(酸)类似物后引起的TDF原发耐药的可能性很小,预测该药在我国治疗对目前四种抗HBV核苷(酸)类似物耐药的患者应具有较好疗效,但V214A和A181V+N236T突变是否影响TDF临床疗效仍值得关注。 展开更多

关键词 慢性乙型肝炎 突变 耐药 替诺福韦酯

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HBV基因组A1846T变异对病毒复制力及核心启动子活性的上调作用研究 被引量：4

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作者 江玲 许智慧 +6 位作者 刘妍 李晓东 姚伟明 李韦杰 戴久增 辛绍杰 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期10-14,共5页

目的评价乙肝病毒(HBV)基因组核苷酸(nt)A1846T变异对病毒体外复制力及核心启动子(CP)转录活性的影响。方法 385例研究对象包括116例轻中度慢性乙肝(CHB-M)患者,123例重度慢性乙肝(CHB-S)患者和146例慢加急性肝衰竭(ACLF)患者。从患者... 目的评价乙肝病毒(HBV)基因组核苷酸(nt)A1846T变异对病毒体外复制力及核心启动子(CP)转录活性的影响。方法 385例研究对象包括116例轻中度慢性乙肝(CHB-M)患者,123例重度慢性乙肝(CHB-S)患者和146例慢加急性肝衰竭(ACLF)患者。从患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增HBV全长基因组,统计A1846T变异的发生率。挑选代表性A1846T变异株HBV全长序列克隆至pGEM-Teasy载体中,并通过定点突变获得野生型对照。BspQⅠ/ScaⅠ双酶切HBV基因组,转染HepG2细胞,检测病毒复制力和HBsAg表达水平;用PCR分别扩增含nt1846变异型和野生型的HBVCP区片段,构建pGL3-CP双荧光素酶真核报告表达载体,转染HepG2细胞,分析检测A1846T变异对荧光素酶表达的影响。结果 HBV A1846T变异发生率随疾病程度加重依次增高,CHB-M、CHB-S和ACLF患者的变异检出率分别为31.03%、42.27%和55.48%(P<0.01)。A1846T变异株的复制力、分泌的HBsAg水平和核心启动子活性较野生株分别提高了320%、28%和85%,常见的CP区A1762T/G1764A双联变异株分别较野生株提高了67%、9%和72%,A1846T变异对提高病毒复制力的影响更强。结论 A1846T变异可显著增加HBV复制力,提高HBsAg表达水平,增强启动子活性,顺式激活下游基因转录表达,提示该变异可能与慢性乙肝重症化发生机制相关。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 肝功能衰竭 突变 启动区 DNA复制

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乙型肝炎患者HBV前S/S蛋白特异性CTL表位变异分析 被引量：4

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作者 许智慧 任晓强 +7 位作者 刘妍 王耀 李晓东 戴久增 李乐 姚增涛 钟彦伟 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期666-669,共4页

目的比较慢性重型乙型肝炎(CSHB)与慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位变异的差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的机制。方法对262例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因并... 目的比较慢性重型乙型肝炎(CSHB)与慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位变异的差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的机制。方法对262例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV前S/S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用VectorNTI软件对目前已知的13个HLA-A2限制性前S/S蛋白特异性CTL表位进行序列分析。结果123例(46.9%)患者HLA-A2阳性,其中CSHB71例,CHB52例。CTL表位变异分析结果如下:(1)两组间所有患者进行比较,患者S177-185和S338-347表位变异发生率有显著差异(P<0.05);(2)两组间HBVB基因型患者进行比较,患者S131-139、S183-191和S204-212表位变异发生率有极显著差异(P<0.01);(3)两组间HBVC基因型患者进行比较,CSHB组患者的S131-139表位较CHB组患者有增高(P=0.05)。结论某些HBV前S/S蛋白特异性CTL表位在CSHB与CHB患者间变异有明显差异,受病毒基因型影响,CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 表位 T淋巴细胞 前S/S蛋白

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接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtM204Q的表型特点分析 被引量：4

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作者 王嫣 刘妍 +5 位作者 许智慧 思兰兰 陈丽 戴久增 姚增涛 徐东平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期548-551,共4页

目的分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点。方法从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测... 目的分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点。方法从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异。将Xho I/Sph I双酶切后的RT片段与载体连接成含HBV 1.1倍基因组长度的重组载体。采用FuGENE HD试剂盒,将构建的含野生株和变异株的重组载体转染至人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后加入不同浓度的核苷(酸)类药物[LAM终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L;阿德福韦酯(ADV)终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L;恩替卡韦(ETV)终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L;替诺福韦酯(TDF)终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L],隔天换药,连续作用4d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下HBV DNA的复制水平,以分析变异株的表型特点。结果对从患者血清获得的37个克隆进行测序分析,结果显示13个(35.1%)为野生型,11个(29.7%)为rtM204Q突变型,2个(5.4%)为rtM204I突变型,10个(27.0%)为rtA181T突变型,1个(2.7%)为rtA181T+rtM204Q突变型。后4种变异株的复制力分别是野生株复制力的89.95%、46.28%、55.77%和34.44%(P<0.05)。前2种变异形式的表型耐药分析结果显示,rtM204Q对LAM的敏感性为野生株的1/75.68,而rtM204I对LAM的敏感性不及野生株的1/1000。rtM204Q和rtM204I株对ADV、ETV和TDF均敏感。结论 HBV RT区新的YQDD基序变异在一定程度上抑制病毒复制力,对LAM的敏感性降低,提示这可能是一个新的LAM耐药相关变异。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 抗药性 病毒 突变

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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A调节新生多肽复合物启动子转录活性的研究 被引量：2

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作者 戴久增 成军 +1 位作者 曲建慧 纪冬 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期579-581,共3页

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对新生多肽相关复合物(NACA) 启动子转录活性的影响。方法以我室构建的能够表达NS5A蛋白的pcDNA3.1(-)-NS5A质粒和含有NACA 基因启动子的pCAT3-NACA报告基因质粒共转染HepG2细胞系设为实验... 目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对新生多肽相关复合物(NACA) 启动子转录活性的影响。方法以我室构建的能够表达NS5A蛋白的pcDNA3.1(-)-NS5A质粒和含有NACA 基因启动子的pCAT3-NACA报告基因质粒共转染HepG2细胞系设为实验组,同时pCAT3-NACA单独转染HepG2细胞系作为对照组。用酶联免疫吸附法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果pCAT3-NACA单独转染HepG2细胞的CAT酶表达活性与pCAT3-NACA和pcDNA3.1(-)-NS5A共转染组HepG2细胞的CAT酶表达活性比较,共转染组A值下降了79.3%。结论HCV NS5A能够抑制NACA 启动子的活性,对NACA的表达具有下调作用。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白5A 调节作用 多肽复合物 启动子 转录活性 NACA HCV

原文传递

核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用 被引量：3

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作者 高学松 成军 +4 位作者 甄真 黄燕萍 郭江 刘妍 戴久增 《世界华人消化杂志》 CAS 2004年第10期2488-2491,共4页

目的:构建HBV核心启动子及NPIP的重组载体,研究NPIP对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及NPIP的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和NPIP基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真... 目的:构建HBV核心启动子及NPIP的重组载体,研究NPIP对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及NPIP的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和NPIP基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在NPIP的影响下,其活性有降低3-4倍.通过体内实验证明NPIP可以下调HBV核心启动子的表达.结论:NPIP明显降低HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的线索. 展开更多

关键词 核孔复合体相互作用蛋白 NPIP 乙型肝炎病毒 核心启动子 转录活性 调节作用

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