目的运用浓度梯度倍增的异烟肼体外诱导获得BCG耐药菌株,并构建体外BCG感染巨噬细胞模型。方法选取野生型BCG,从1/8最低抑菌浓度开始,在异烟肼浓度倍增的7H9培养基上进行传代培养,逐步诱导菌株对异烟肼的耐药性;采用微量肉汤稀释法,进行...目的运用浓度梯度倍增的异烟肼体外诱导获得BCG耐药菌株,并构建体外BCG感染巨噬细胞模型。方法选取野生型BCG,从1/8最低抑菌浓度开始,在异烟肼浓度倍增的7H9培养基上进行传代培养,逐步诱导菌株对异烟肼的耐药性;采用微量肉汤稀释法,进行BCG药敏实验;通过耐药基因测序来验证耐药诱导是否成功;通过PMA刺激Thp1细胞,诱导分化成M0巨噬细胞;运用CCK实验,进行BCG感染巨噬细胞的细胞活性测定;通过流式细胞术分析野生型BCG或异烟肼耐药BCG感染巨噬细胞的极化状态。结果野生型BCG的MIC值为0.125μg/ml,异烟肼耐药BCG的MIC值>128μg/ml;异烟肼耐药基因inhA和katG测序后比对发现,inhA有T→G突变,katG有A→T突变;CCK实验确定合适的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为=10;异烟肼耐药BCG较野生型BCG感染巨噬细胞后,其向M1型极化减少。结论采用异烟肼浓度梯度倍增方式,成功诱导了耐药BCG;确定了耐药BCG感染巨噬细胞的感染复数,为研究体内异烟肼耐药结核病提供了良好的体外细胞模型。展开更多
文摘目的运用浓度梯度倍增的异烟肼体外诱导获得BCG耐药菌株,并构建体外BCG感染巨噬细胞模型。方法选取野生型BCG,从1/8最低抑菌浓度开始,在异烟肼浓度倍增的7H9培养基上进行传代培养,逐步诱导菌株对异烟肼的耐药性;采用微量肉汤稀释法,进行BCG药敏实验;通过耐药基因测序来验证耐药诱导是否成功;通过PMA刺激Thp1细胞,诱导分化成M0巨噬细胞;运用CCK实验,进行BCG感染巨噬细胞的细胞活性测定;通过流式细胞术分析野生型BCG或异烟肼耐药BCG感染巨噬细胞的极化状态。结果野生型BCG的MIC值为0.125μg/ml,异烟肼耐药BCG的MIC值>128μg/ml;异烟肼耐药基因inhA和katG测序后比对发现,inhA有T→G突变,katG有A→T突变;CCK实验确定合适的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为=10;异烟肼耐药BCG较野生型BCG感染巨噬细胞后,其向M1型极化减少。结论采用异烟肼浓度梯度倍增方式,成功诱导了耐药BCG;确定了耐药BCG感染巨噬细胞的感染复数,为研究体内异烟肼耐药结核病提供了良好的体外细胞模型。
