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pcDNA3.1/myc-His-DJ-1^(M26I)重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究 被引量：3
1
作者 张梅英 徐影琪 +6 位作者 王惟 赵越 杨葳 于萌 郭晓冲 秦英 郑志红 《中国比较医学杂志》 CAS 2012年第1期28-33,共6页
目的构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1... 目的构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P<0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P<0.05)。结论成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1 M26I的NIH3T3细胞。DJ-1 M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡。 展开更多
关键词 DJ-1 NIH3T3细胞 帕金森 凋亡
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一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法 被引量：1
2
作者 王金霞 徐影琪 +3 位作者 魏政立 杨葳 张梅英 郑志红 《辽宁农业科学》 2016年第4期27-32,共6页
在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-... 在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-C-Shield1系统可以解决这个问题,能人为控制蛋白表达或降解,避免胚胎致死。本实验以小GTP酶腺苷二磷酸核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)为例,借助EL350细菌中Red/ET重组作用,使用DD-C-Shield1系统和重叠延伸PCR方法,发展一种通用的可实现蛋白可逆表达的构建敲入载体的方法。该方法缩短了构建时间,减少了重组的步骤,不需要使用rps L-neo DNA、链霉素和酶切位点。此敲入载体两侧同源臂5 kb左右,可用传统的ES打靶方法构建敲入小鼠,经过简单改造也可使用CRISPR/Cas9方法构建敲入细胞或小鼠模型,从而在细胞和动物模型中进行条件性修饰、快速、可逆地调节特异性蛋白表达,以利于发育学研究,为细胞和活体生物严谨调控蛋白功能提供了一种新的策略。 展开更多
关键词 FKBP(L106P)不稳定结构域(DD-C) Shield1 敲入载体 重叠延伸PCR 可逆降解
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pcDNA3．1／myc-His-DJ-1^M26I真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞中表达
3
作者 张梅英 王惟 +6 位作者 徐影琪 赵越 杨葳 于萌 郭晓冲 秦英 郑志红 《实验动物与比较医学》 CAS 2012年第2期111-115,共5页
目的构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，为进一步研究DJ-1^M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变，分别构建pcDNA3．1／myc-his—DJ-1和pcDNA... 目的构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，为进一步研究DJ-1^M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变，分别构建pcDNA3．1／myc-his—DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc—his-DJ-1^M26I质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆，对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平鉴定。结果pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his—DJ-1^M26I质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后，经PCR检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆，RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测，结果均证明外源插入基因的表达，MTT实验结果初步证明转染DJ-1^M26I基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组（P〈0．05）。结论成功构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达质载体。 展开更多
关键词 DJ-1 NIH3T3细胞 帕金森氏病
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应用Talen法制备apoE基因敲除大鼠模型
4
作者 徐影琪 李晓晶 +9 位作者 杨葳 周生来 于洋 王惟 张婀娜 赵文 张梅英 郭大勇 王宏宇 郑志红 《实验动物与比较医学》 CAS 2015年第4期277-282,共6页
目的应用转录激活因子样效应因子核酸酶（Talen）法制备载脂蛋白E（apoE）基因敲除大鼠模型，为进一步研究apoE基因功能，动脉粥样硬化（AS）疾病发病机制及治疗方法奠定基础。方法设计并合成针对大鼠apoE基因的Talen序列，应用原核显... 目的应用转录激活因子样效应因子核酸酶（Talen）法制备载脂蛋白E（apoE）基因敲除大鼠模型，为进一步研究apoE基因功能，动脉粥样硬化（AS）疾病发病机制及治疗方法奠定基础。方法设计并合成针对大鼠apoE基因的Talen序列，应用原核显微注射方法制备子代鼠。通过PCR．测序及TA克隆-测序法检测仔鼠中apoE的突变，经传代及兄妹交配获得纯合型仔鼠，并对其基因型进行鉴定。应用Westemblot方法检测apoE-/-仔鼠各组织中ApoE蛋白表达水平；血清学分析血脂总胆固醇（CHO）及甘油三酯（TG）含量；应用RT—PCR方法检测脂质代谢相关基因三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）的表达。结果经鉴定选取在第二外显子处缺失1bp，造成开放阅读框移码突变的大鼠为阳性F0代仔鼠，该鼠经传代及筛选，最终获得apoE-/-大鼠。Westernblot检测显示apoE-/-鼠在心、肝、肾、脑、卵巢组织中未见ApoE蛋白的表达，表明在该模型中成功实现了apoE基因的敲除。apoE-/-鼠血脂CHO、TG均高于野生SD大鼠，其中CHO水平呈现显著性差异（P〈0．05）。在apoE-/-鼠肝组织中ABCA1的表达降低，可能起到促进AS形成的作用。结论应用Talen法成功制备apoE基因敲除SD大鼠；经筛选获得了纯合型apoE-/-大鼠，该模型实现了apoE基因敲除，并表现为高血脂及As性状。 展开更多
关键词 转录激活因子样效应因子核酸酶(Talen) 载脂蛋白E(ApoE) 基因敲除 大鼠
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正反向Penetratin转导肽细胞穿膜效率的初步比较
5
作者 郭庆国 徐影琪 叶翠 《沈阳师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2013年第3期425-429,共5页
目的:实验致力于研究正反向细胞穿膜肽Penetratin携带工具的穿膜效率,为进一步解决大分子药物的临床应用奠定基础。方法:通过质粒构建重组成融合质粒载体pET-28a-EGFP,pET-28a-Penetratin(+)-EGFP和pET-28a-Penetratin(-)-EGFP,分别在BL... 目的:实验致力于研究正反向细胞穿膜肽Penetratin携带工具的穿膜效率,为进一步解决大分子药物的临床应用奠定基础。方法:通过质粒构建重组成融合质粒载体pET-28a-EGFP,pET-28a-Penetratin(+)-EGFP和pET-28a-Penetratin(-)-EGFP,分别在BL21(DE3)中进行表达、经过His标签蛋白纯化柱纯化,得到比较纯的融合蛋白,然后用这些蛋白与HeLa细胞共同孵育,进行蛋白质的穿细胞功能检测。结果:His-Penetratin(+)-EGFP和His-Penetratin(-)-EGFP穿细胞膜能力类似,而His-EGFP不具有细胞穿膜功能。结论:经过研究验证正向和反向序列Penetratin穿膜能力类似,并且两种融合蛋白穿膜机制与膜受体无关,属于被动运输的一种,两种融合蛋白对细胞无创伤作用,为开发新药成功建立了技术平台。 展开更多
关键词 Penetratin蛋白转导 质粒构建 绿色荧光蛋白 穿膜 介导
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DJ-1^(L166P)与DJ-1^(M26I)基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较
6
作者 张梅英 任萍萍 +7 位作者 徐影琪 王惟 赵越 杨葳 于萌 郭晓冲 秦英 郑志红 《中国比较医学杂志》 CAS 2012年第4期10-14,共5页
目的在细胞学水平比较DJ、DJ-1M26 I、DJ-1L166 P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础。方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-D... 目的在细胞学水平比较DJ、DJ-1M26 I、DJ-1L166 P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础。方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166 P和DJ-1M26 I组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P<0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P<0.05)。结论 DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的。 展开更多
关键词 DJ-1 NIH3T3细胞 帕金森 凋亡
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