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受体酪氨酸激酶AXL影响新城疫病毒复制及干扰素刺激基因产生的研究 被引量：1
1
作者 徐丘璠 黄美珍 +8 位作者 黄新月 仇旭升 孙英杰 廖瑛 宋翠萍 刘炜玮 丁铲 谭磊 任涛 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1299-1305,共7页
受体酪氨酸激酶AXL是TAM家族(由TYRO3、AXL和MERTK组成)的成员之一,在机体的许多生理和病理条件下发挥重要作用。为探究AXL对新城疫病毒(NDV)复制及干扰素刺激基因(ISGs)产生的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计了2条AXL的sgRNA和1条... 受体酪氨酸激酶AXL是TAM家族(由TYRO3、AXL和MERTK组成)的成员之一,在机体的许多生理和病理条件下发挥重要作用。为探究AXL对新城疫病毒(NDV)复制及干扰素刺激基因(ISGs)产生的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计了2条AXL的sgRNA和1条阴性对照sgRNA,并分别插入LentiCRISPRv2中构建LentiCRISPRv2-AXL-1、LentiCRISPRv2-AXL-2及阴性对照质粒LentiCRISPRv2-AXL-control,并经菌液PCR和测序鉴定正确后分别与pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞,获得相应重组慢病毒,分别命名为rLenti-AXL1、rLentiAXL2和rLenti-control。同时筛选药物Puromycin对DF-1细胞的最佳使用浓度;将上述慢病毒分别感染DF-1细胞,48 h后利用qPCR检测sgRNA的敲低效果;将敲低效率较高的重组慢病毒感染DF-1细胞,并经最适浓度的Puromycin筛选和亚克隆纯化后获得的细胞分别经qPCR和western blot检测AXL基因及其蛋白水平;将获得的细胞连续传10代后分别取第2、4、6、8、10代细胞经qPCR检测其遗传稳定性。结果显示,2.5μg/mL为Puromycin的最适筛选浓度;qPCR结果显示,rLenti-AXL1和rLenti-AXL2均能敲低DF-1细胞中的AXL基因水平,但后者的敲低效率较高,因此选择rLenti-AXL2进行后续试验;经Puromycin筛选细胞3次后经亚克隆纯化,获得了3株敲低AXL基因的细胞;细胞的qPCR和western blot结果显示,3株细胞中AXL基因及蛋白表达水平均极显著降低;遗传稳定性结果显示,各代细胞中AXL基因的转录水平仍然较低。上述结果表明,获得了敲低AXL基因表达的DF-1细胞系,命名为AXL-KD DF-1细胞。将MOI 1的NDV分别感染DF-1和AXL-KD DF-1细胞后,分别经qPCR和western blot检测Mx1和IFIT5基因的转录水平及细胞中NDV NP蛋白水平。结果显示:无论是否感染NDV,AXL-KD DF-1细胞中Mx1和IFIT5基因的转录水平均显著升高1倍左右(p<0.05);且相比于DF-1细胞,感染NDV的AXL-KD DF-1细胞中NP蛋白的表达量均极显著下降(p<0.0001)。综上结果表明,敲低细胞� 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 AXL基因 干扰素刺激基因 新城疫病毒
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禽传染性支气管炎病毒拮抗JAK-STAT信号通路的研究
2
作者 楚红燕 宫晓倩 +9 位作者 徐丘璠 仇旭升 谭磊 孙英杰 刘炜玮 宋翠萍 钱琨 丁铲 廖瑛 陈丽颖 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第4期49-56,共8页
已有报道显示冠状病毒拮抗干扰素下游JAK-STAT信号通路,然而,关于传染性支气管炎病毒(IBV)对JAK-STAT信号通路的拮抗,鲜有报道。本文通过Western blot试验,证实IBV感染抑制STAT1和STAT2的磷酸化;间接免疫荧光实验证实IBV和nsp15核酸酶... 已有报道显示冠状病毒拮抗干扰素下游JAK-STAT信号通路,然而,关于传染性支气管炎病毒(IBV)对JAK-STAT信号通路的拮抗,鲜有报道。本文通过Western blot试验,证实IBV感染抑制STAT1和STAT2的磷酸化;间接免疫荧光实验证实IBV和nsp15核酸酶活性缺陷型重组病毒rIBV-nsp15-H238A均能抑制STAT1的核转位,说明IBV感染确实拮抗JAK-STAT信号通路,且nsp15核酸酶活性不是必需的。进一步实验证明,IBV编码的核酸内切酶nsp15,能够抑制内源性和外源性的STAT1表达,并且nsp15的核酸酶活性位点及其三聚化能力都是必需的。由于nsp15缺陷型毒株rIBV-nsp15-H238A能够跟野生型IBV一样拮抗JAK-STAT信号通路,推测IBV还编码其他蛋白,作用于JAK-STAT信号通路,需要进一步对病毒蛋白进行筛选和研究。 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒 JAK-STAT信号通路 核糖核酸内切酶nsp15
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鸡血小板衍生生长因子受体α基因的分子克隆及其真核表达蛋白鉴定
3
作者 杨晓凤 徐丘璠 +7 位作者 乔长涛 仇旭升 孙英杰 宋翠萍 孟春春 廖瑛 丁铲 谭磊 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第5期157-163,共7页
鸡血小板衍生生长因子受体α(chPDGFRα)是PDGFRs家族的一种,属于受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员。本研究首先运用RT-PCR技术从鸡骨髓源树突状细胞(chBM-DCs)中分子克隆得到PDGFRα基因,然后将基因片段分别定向克隆至真核表达载体pCMV-HA... 鸡血小板衍生生长因子受体α(chPDGFRα)是PDGFRs家族的一种,属于受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员。本研究首先运用RT-PCR技术从鸡骨髓源树突状细胞(chBM-DCs)中分子克隆得到PDGFRα基因,然后将基因片段分别定向克隆至真核表达载体pCMV-HA和p3XFLAG-CMV-14中,构建出重组chPDGFRα表达质粒pHA-PDGFRα和pFLAG-PDGFRα,经酶切鉴定及DNA测序验证正确后,分别瞬时转染至HEK293T细胞,通过Western blot和IFA进行检测。结果表明成功构建了pHA-PDGFRα和pFLAG-PDGFRα重组表达质粒,为深入研究chPDGFRα蛋白在抗病毒免疫中的分子作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡血小板衍生生长因子受体α 树突状细胞 分子克隆 真核表达
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