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荧光RT-PCR快速检测禽流感病毒H5亚型的研究 被引量：39
1
作者 朱文斯 赖平安 +2 位作者 黄茜华 张鹤晓 杨伟 《中国医药导刊》 2003年第1期27-30,共4页
本研究根据禽流感病毒H5亚型的RNA4节段,设计、合成多对引物、探针,并通过筛选获得灵敏度、特异性好的组合,在此基础上对荧光RT-RCR反应体系中的各组分进行优化,并建立对各种禽类样品中病毒核酸的提取方法。通过对阳性鸡胚尿囊液及人工... 本研究根据禽流感病毒H5亚型的RNA4节段,设计、合成多对引物、探针,并通过筛选获得灵敏度、特异性好的组合,在此基础上对荧光RT-RCR反应体系中的各组分进行优化,并建立对各种禽类样品中病毒核酸的提取方法。通过对阳性鸡胚尿囊液及人工攻毒的SPF鸡、肉鸡、肉鸭的各脏器进行检测,并与传统鸡胚病毒分离进行对比,显示该方法与传统鸡胚病毒分离灵敏度接近,但检测时间由原来的21天缩短为4小时。 展开更多
关键词 荧光RT-PCR 快速检测 禽流感病毒H5亚型 研究 传染病
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荧光RT-PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究 被引量：28
2
作者 张鹤晓 赖平安 +12 位作者 刘环 刘继红 郭晋优 谷强 张利峰 汪琳 段生涛 张向东 朱文斯 杨伟 黄茜华 赖少梅 李宁 《检验检疫科学》 2004年第1期1-5,共5页
本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列 ,开发、设计多条引物和探针序列 ,从中筛选敏感、特异的引物、探针 ,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上 ,建立了快速的通用型“一步法”检测活禽或禽产品中所有A型禽流... 本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列 ,开发、设计多条引物和探针序列 ,从中筛选敏感、特异的引物、探针 ,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上 ,建立了快速的通用型“一步法”检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT -PCR检测技术。该方法敏感性高、特异性强 ,与国际标准方法———世界动物卫生组织 (OIE)确定的鸡胚病毒分离相比 ,敏感性基本一致 ,可直接用来检测咽喉 /泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒 ,将检测时间从原来最短所需要的 2 1d缩短为 4h。 展开更多
关键词 荧光RT-PCR 检测 禽流感病毒 血凝素 神经氨酸酶
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免疫胶体金技术及其在检验检疫中的应用 被引量：21
3
作者 汪琳 周琦 +1 位作者 赖平安 张鹤晓 《检验检疫科学》 2004年第4期56-58,共3页
免疫胶体金技术是四大免疫标记技术之一 ,问世 2 0多年来发展十分迅速 ,在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。本文从胶体金技术的基本原理、制备方法、标记技术和实际应用等几个方面对胶体金技术作较系统的介... 免疫胶体金技术是四大免疫标记技术之一 ,问世 2 0多年来发展十分迅速 ,在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。本文从胶体金技术的基本原理、制备方法、标记技术和实际应用等几个方面对胶体金技术作较系统的介绍 ,分析胶体金技术在检验检疫中的广阔应用前景。 展开更多
关键词 免疫胶体金 检验检疫 免疫层析法 快速免疫金渗滤法 稳定性 制备方法
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Dot─ELISA检测猪生殖和呼吸综合征抗体的研究 被引量：13
4
作者 王刚 张鹤晓 +6 位作者 甘孟侯 王彩兰 崔向东 苏世敏 张玉忠 张兆平 李文刚 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 1996年第10期3-5,共3页
用差速离心法提纯ＰＲＲＳ病毒，利用ＮＣ膜作为载体，在国内外首次成功建立了检测ＰＲＲＳ血清抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。抗原包被浓度为１００μｇ／ｍｌ，被检血清工作浓度为１∶１０，酶标兔抗猪ＩｇＧ工... 用差速离心法提纯ＰＲＲＳ病毒，利用ＮＣ膜作为载体，在国内外首次成功建立了检测ＰＲＲＳ血清抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。抗原包被浓度为１００μｇ／ｍｌ，被检血清工作浓度为１∶１０，酶标兔抗猪ＩｇＧ工作浓度为１∶６００。对７２份北京地区猪血清分别用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＩＦ检测，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测阳性率为３３．３％，ＩＦ检测阳性率为３０．６％，与ＩＦ符合率较高，对部分待检血清检测结果表明：６１份１９９１年进口美国猪血清阳性率为０％，１８２份１９９５年进口加拿大猪血清阳性率为４．９４％。本法不需特殊仪器。 展开更多
关键词 猪病 生殖呼吸综合征 DOT-ELISA 抗体 检测
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荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究 被引量：18
5
作者 张利峰 张鹤晓 +5 位作者 乔卫虹 吴丹 高小博 杨伟 王莉 夏春 《检验检疫科学》 2005年第6期22-25,共4页
本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术。同时,又将该... 本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术。同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4。本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究。结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液。 展开更多
关键词 荧光RT—PCR 鲤春病毒血症 鲤春病毒血症病毒 荧光RT-PCR检测 PCR方法 鱼类 TCID50 病毒含量 检测样品 病毒核酸
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酶联免疫吸附试验检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究 被引量：15
6
作者 张鹤晓 王彩兰 +4 位作者 崔向东 王刚 苏世敏 张玉忠 甘孟侯 《中国兽医科技》 CSCD 1997年第1期8-10,共3页
建立的检测猪生殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）抗体的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），其抗原包被浓度为１．７ｍｇ／Ｌ，血清的最适稀释度为１∶１００，酶标兔抗猪ＩｇＧ的工作浓度为１∶２０００。比较试验表明，ＥＬＩＳＡ的敏感性优... 建立的检测猪生殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）抗体的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），其抗原包被浓度为１．７ｍｇ／Ｌ，血清的最适稀释度为１∶１００，酶标兔抗猪ＩｇＧ的工作浓度为１∶２０００。比较试验表明，ＥＬＩＳＡ的敏感性优于间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）。用ＥＬＩＳＡ检测１９９１年从美国进口猪的血清７６份，阳性率为零；１９９５年从加拿大进口猪的血清１６３份，阳性率为５．５２％；北京地区甲猪场的血清１２１份，阳性率为４７．１％；北京地区乙猪场的血清４３份，阳性率为４１．８％ 展开更多
关键词 酶联免疫吸附 生殖呼吸综合症 抗体 猪病
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牛肠道病毒2型的分离与鉴定 被引量：20
7
作者 彭小薇 董浩 +3 位作者 吴丹 张鹤晓 吴清民 吕艳丽 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期823-828,共6页
本研究从北京某牛场发生严重腹泻的泌乳奶牛采集直肠拭子,接种MDBK细胞,分离获得1株病毒,命名为BJ001。理化特性鉴定结果表明,该病毒大小约30nm,为无囊膜的RNA病毒;用随机PCR方法对氯化铯梯度离心后的各区带扩增,扩增产物凝胶电泳后,回... 本研究从北京某牛场发生严重腹泻的泌乳奶牛采集直肠拭子,接种MDBK细胞,分离获得1株病毒,命名为BJ001。理化特性鉴定结果表明,该病毒大小约30nm,为无囊膜的RNA病毒;用随机PCR方法对氯化铯梯度离心后的各区带扩增,扩增产物凝胶电泳后,回收"呈彗尾样拖带现象"最明显的区带2的500～1 500bp的片段进行序列测定与分析,结果显示,扩增片段与GenBank中已知的牛肠道病毒2型相似性较高;用BEV2型特异性引物对病毒进行RT-PCR扩增,并将扩增产物进行序列测定与分析,结果表明,其与BEV2相似性最高可达93%。故该病毒被确定为牛肠道病毒2型。将该病毒接种2头成年健康奶牛,均未出现肉眼可见的临床症状,但病毒可在接种奶牛体内持续存在,并产生较高滴度抗体。 展开更多
关键词 牛肠道病毒2型 分离与鉴定 理化特性 随机PCR
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常用禽流感检测技术及其在检验检疫领域中的应用 被引量：8
8
作者 王永卫 张利峰 张鹤晓 《检验检疫科学》 2003年第5期51-53,共3页
通过对目前常用的禽流感检测技术如琼脂凝胶扩散试验 (AGP)、血细胞凝集抑制试验 (HI)、鸡胚病毒分离试验、ELISA方法、免疫荧光技术、RT -PCR技术和荧光RT -PCR技术等试验方法和技术收集和分析 ,以及这些技术在检验检疫领域的应用 ,探... 通过对目前常用的禽流感检测技术如琼脂凝胶扩散试验 (AGP)、血细胞凝集抑制试验 (HI)、鸡胚病毒分离试验、ELISA方法、免疫荧光技术、RT -PCR技术和荧光RT -PCR技术等试验方法和技术收集和分析 ,以及这些技术在检验检疫领域的应用 ,探讨了这些方法的优缺点和在检验检疫领域应用的实用性。最后重点介绍了在检验检疫领域最具有应用优势的荧光RT -PCR方法检测禽流感的技术。 展开更多
关键词 禽流感 检验检疫 检测技术 荧光RT-PCR方法
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应用间接免疫荧光试验从猪群中检测出PRRS抗体 被引量：10
9
作者 张鹤晓 王刚 +4 位作者 王彩兰 崔向东 苏世敏 于文军 张玉忠 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 1996年第11期7-8,共2页
应用间接免疫荧光试验从猪群中检测出ＰＲＲＳ抗体张鹤晓王刚王彩兰崔向东苏世敏于文军张玉忠（中华人民共和国北京动植物检疫局，１０００２９）１９９５年末以来，北京地区的某些猪场发生以母猪流产、死产为特征的疾病，我们用猪的繁... 应用间接免疫荧光试验从猪群中检测出ＰＲＲＳ抗体张鹤晓王刚王彩兰崔向东苏世敏于文军张玉忠（中华人民共和国北京动植物检疫局，１０００２９）１９９５年末以来，北京地区的某些猪场发生以母猪流产、死产为特征的疾病，我们用猪的繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）欧洲株和... 展开更多
关键词 间接免疫荧光法 猪病 繁殖呼吸综合症 抗体
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非洲马瘟病毒VP7基因拼接、表达及重组ELISA方法的建立与初步应用 被引量：11
10
作者 高志强 张鹤晓 +7 位作者 赖平安 谷强 蒲静 汪琳 乔彩霞 吴丹 柏亚铎 张伟 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1548-1553,共6页
采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(AHSV)含有绝大多数线性抗原表位的VP7编码基因片段,克隆于pET-30a构建重组质粒pET-30a-VP7,将pET-30a-VP7转化BL21(DE3),经1.0 mmol/L IPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。通过Dot-EL... 采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(AHSV)含有绝大多数线性抗原表位的VP7编码基因片段,克隆于pET-30a构建重组质粒pET-30a-VP7,将pET-30a-VP7转化BL21(DE3),经1.0 mmol/L IPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。通过Dot-ELISA以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测AHSV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为0.25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性临界值初步定为0.25。用此方法和商品化ELISA试剂盒检测了184份血清样品,结果完全符合。 展开更多
关键词 非洲马瘟 基因拼接 重组ELISA
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牛肠道病毒2型VP1^+表达和间接ELISA方法的建立与应用 被引量：10
11
作者 郭金玉 高志强 +2 位作者 张鹤晓 张乐萃 吴丹 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2014年第11期40-43,共4页
根据2005年从北京某牛场分离得到的一株牛肠道病毒2型(BEV-2)毒株序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增BEV-2包含VP1(840 bp)蛋白基因片段的VP1+(1 275 bp)序列,扩增产物克隆到p MD-T19,进行测序验证。验证该序列为目的片段后,将其... 根据2005年从北京某牛场分离得到的一株牛肠道病毒2型(BEV-2)毒株序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增BEV-2包含VP1(840 bp)蛋白基因片段的VP1+(1 275 bp)序列,扩增产物克隆到p MD-T19,进行测序验证。验证该序列为目的片段后,将其克隆到表达载体p ET-32a。重组质粒转化至Rosetta,经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示重组蛋白在大肠杆菌中高效表达。将重组蛋白作检测抗原包被酶标板,成功建立了检测牛肠道病毒2型抗体的间接ELISA方法。上述工作,为下一步BEV-2单克隆抗体的制备打下了基础。 展开更多
关键词 牛肠道病毒2型 重组表达 间接ELISA
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应用间接酶联免疫吸附试验检测猪生殖和呼吸综合征病毒抗体的研究 被引量：9
12
作者 查红波 陈西钊 +3 位作者 张鹤晓 蒋金书 赵继勋 蒋进 《中国兽医科技》 CSCD 1997年第9期20-21,共2页
应用间接酶联免疫吸附试验检测猪生殖和呼吸综合征病毒抗体的研究查红波陈西钊张鹤晓１）蒋金书赵继勋蒋进（中国农业大学动物医学院北京１０００９４）自１９８７年在美国发现猪生殖和呼吸综合征（ＰＲＲＳ）以来，世界各地均有报道。... 应用间接酶联免疫吸附试验检测猪生殖和呼吸综合征病毒抗体的研究查红波陈西钊张鹤晓１）蒋金书赵继勋蒋进（中国农业大学动物医学院北京１０００９４）自１９８７年在美国发现猪生殖和呼吸综合征（ＰＲＲＳ）以来，世界各地均有报道。迄今检测ＰＲＲＳ抗体的方法有间接免... 展开更多
关键词 猪病 生殖呼吸综合症 病毒 抗体 ELISA
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新城疫病毒通用型实时RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：6
13
作者 张鹤晓 高志强 +7 位作者 赖平安 张利峰 谷强 杨伟 刘继红 郭晋优 段生涛 张向东 《动物医学进展》 CSCD 2005年第11期53-56,共4页
采用Taq Man方法,经引物和探针的设计、筛选及反应条件优化,研究了检测活禽和禽产品中新城疫病毒的通用型实时RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果显示,对12株分别为速发型、中发型、缓发型和疫苗株新城疫病毒的尿囊液倍比稀释液的检测极限在10-5... 采用Taq Man方法,经引物和探针的设计、筛选及反应条件优化,研究了检测活禽和禽产品中新城疫病毒的通用型实时RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果显示,对12株分别为速发型、中发型、缓发型和疫苗株新城疫病毒的尿囊液倍比稀释液的检测极限在10-5～10-7之间;建立的方法与常见禽类病毒无交叉反应,特异性良好;在检测人工感染肉鸡的脏器组织、咽喉、泄殖腔拭子中病毒的灵敏度同鸡胚分离试验基本一致;弱毒疫苗免疫鸡群在免疫后14 d,应用本方法不能从咽喉、泄殖腔拭子中检测到病毒;临床样品检测表明,该方法不仅可以检出中强毒力新城疫毒株,也可检出缓发型野毒株和疫苗毒株. 展开更多
关键词 新城疫病毒 实时RT—PCR
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牛肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：9
14
作者 吴丹 吴涛 +6 位作者 张鹤晓 高志强 蒲静 张伟 乔彩霞 谷强 夏春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期903-906,共4页
为建立快速、准确地检测牛肠道病毒(BEV)及对北京周边地区牛群中BEV感染情况进行检测,本研究通过设计合成扩增BEV 5'UTR序列的引物及探针建立了检测BEV的通用型TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法并对反应条件进行了优化。该方法对BE... 为建立快速、准确地检测牛肠道病毒(BEV)及对北京周边地区牛群中BEV感染情况进行检测,本研究通过设计合成扩增BEV 5'UTR序列的引物及探针建立了检测BEV的通用型TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法并对反应条件进行了优化。该方法对BEV的最小检测量为0.1 TCID50/0.1 mL,敏感性比病毒分离法高10倍。而且该方法对其他牛相关病毒均无交叉反应。用3批试剂对3个稀释度的BEV培养物进行批内和批间重复性试验,其变异系数均小于1.1%,表明该方法具有良好的重复性。采用该方法对北京周边地区牛群采集的852份临床样品进行检测,并与病毒分离方法比较,两种方法检测结果完全一致。因此,本研究所建立的BEVTaqMan RT-PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为国内BEV的检测提供了有力的技术支持。本研究首次通过病毒核酸检测证明了我国部分地区的牛群中存在BEV感染。 展开更多
关键词 牛肠道病毒 TAQMAN RT-PCR 病毒核酸检测
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新城疫病毒核酸检测标准物质研究 被引量：9
15
作者 谷强 张伟 +5 位作者 高志强 张鹤晓 刘环 蒲静 乔彩霞 张利峰 《中国动物检疫》 CAS 2012年第11期40-43,共4页
分别设计了3对引物,从灭活新城疫病毒F48E9株和Lasota疫苗株病毒提取的RNA中扩增了完整的M、FA和HN基因编码序列,并克隆于pGEM-T。经测序确认后,采用体外转录方法制备了6种RNA纯品。初步定量后,用RNA保存液稀释至含量约108拷贝数/mL,分... 分别设计了3对引物,从灭活新城疫病毒F48E9株和Lasota疫苗株病毒提取的RNA中扩增了完整的M、FA和HN基因编码序列,并克隆于pGEM-T。经测序确认后,采用体外转录方法制备了6种RNA纯品。初步定量后,用RNA保存液稀释至含量约108拷贝数/mL,分装。分装后均一性检测结果显示瓶间差异<5%,稳定性实验表明室温20～25℃(相对湿度20%～50%)14天稳定;长期监测结果表明:2～8℃6个月及-20℃保存1年的含量均无明显变化。委托多家实验室采用外标实时荧光定量RT-PCR检测方法对制备的标准物质进行准确定值。以上结果表明该制备物可以作为新城疫病毒的核酸检测标准物质。 展开更多
关键词 新城疫病毒 核酸扩增 标准物质
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动物病毒核酸检测质控品和标准物质研究进展 被引量：9
16
作者 乔彩霞 张鹤晓 +3 位作者 高志强 蒲静 汪琳 刘环 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期582-584,共3页
近年来，以核酸扩增为基础的分子检测技术，以其快速、敏感、特异、定量准确，而且对实验室生物安全环境要求低等特点，在动物疫病病原的检测中得到了广泛的应用，逐渐成为动物疫病检测的主流技术。
关键词 病毒核酸检测 动物疫病 标准物质 质控 分子检测技术 核酸扩增 安全环境 疫病检测
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亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸检测标准物质的制备研究 被引量：8
17
作者 吴亚琼 高志强 +7 位作者 吴延功 张鹤晓 乔彩霞 张利峰 单虎 尹燕博 朱淑芬 王慧珊 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2012年第8期8-12,共5页
针对目前口蹄疫病毒核酸扩增检测缺乏标准物质的现状,以口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型核酸为模板,分别设计引物扩增具有检测意义的5′端1nt～2208nt的片段(含完整的5′NCR)和3012nt～5155nt片段(含完整1D～2B区域),并克隆于pMD20-T。测序后采用体... 针对目前口蹄疫病毒核酸扩增检测缺乏标准物质的现状,以口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型核酸为模板,分别设计引物扩增具有检测意义的5′端1nt～2208nt的片段(含完整的5′NCR)和3012nt～5155nt片段(含完整1D～2B区域),并克隆于pMD20-T。测序后采用体外转录方法制备2种RNA纯品,进行初步定量稀释后等量混合分装。采用荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验后,委托外部实验室对RNA片段进行拷贝数定值。结果显示,制备的标准品均匀性和稳定性良好。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 亚洲Ⅰ型 核酸扩增 标准物质
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中强毒力新城疫病毒(NDV)荧光RT-PCR检测方法建立及体系优化 被引量：6
18
作者 张鹤晓 赖平安 +3 位作者 孙颖杰 朱文斯 杨伟 李宁 《检验检疫科学》 2003年第3期1-4,共4页
根据新城疫病毒F基因序列 ,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针 ,从中筛选出最佳引物、探针配对 ,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化 ,... 根据新城疫病毒F基因序列 ,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针 ,从中筛选出最佳引物、探针配对 ,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化 ,建立了快速检测中强毒力新城疫病毒的方法-荧光RT -PCR。 展开更多
关键词 中强毒力 新城疫病毒 荧光RT-PCR检测 禽类 急性传染病
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戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用 被引量：7
19
作者 乔彩霞 张鹤晓 +8 位作者 赖平安 高志强 汪琳 蒲静 吴丹 柏亚铎 谷强 张伟 段向英 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期892-897,共6页
利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针,并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上... 利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针,并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上,建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料,而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果,证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×10^1拷贝/反应,相比于巢式RT-PCR方法,其灵敏度高10-100倍以上。在对54份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。 展开更多
关键词 戊型肝炎病毒 实时定量RT-PCR TaqMan荧光探针
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检测伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR方法的建立 被引量：8
20
作者 朱淑芬 朱瑞良 +5 位作者 乔彩霞 高志强 张利峰 张鹤晓 吴亚琼 王慧珊 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1413-1417,共5页
利用DNAMAN软件对GenBank登录的伪狂犬病病毒(PRV)各毒株gB基因序列进行比对分析,选择其保守区域设计合成特异性的引物和TaqMan探针,同时利用普通PCR技术扩增获得全长的伪狂犬病毒gB基因,并克隆到pMD20-T载体上作为阳性标准品。通过对... 利用DNAMAN软件对GenBank登录的伪狂犬病病毒(PRV)各毒株gB基因序列进行比对分析,选择其保守区域设计合成特异性的引物和TaqMan探针,同时利用普通PCR技术扩增获得全长的伪狂犬病毒gB基因,并克隆到pMD20-T载体上作为阳性标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种快速检测伪狂犬病病毒的荧光定量PCR技术。该检测技术具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。对制备的pMD-gB阳性标准品的检测结果表明,所建立的伪狂犬病毒TaqMan荧光定量PCR最低检测极限可达1.50×102拷贝/反应;同时相比于普通PCR方法其灵敏度高100～1 000倍以上,并且重复性好。在对60份临床样品的检测中,荧光定量PCR不仅检出了普通PCR检测为阳性的样品,且检出了2份普通PCR未检出的样品,进一步证实了该方法快速、灵敏性好,可用于PRV感染的早期快速定量检测和肉类食品进出口检疫。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 GB基因 荧光定量PCR 检测
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