江苏地区奶牛场bla NDM阳性大肠杆菌的分子流行病学 被引量：7

1

作者 王警 张雪寒 +3 位作者 郭芸芸 张碧成 吴庆侠 何孔旺 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第2期391-397,共7页

为了调查江苏地区奶牛场大肠杆菌中blaNDM基因的分子流行病学特征。从江苏部分地区3个奶牛场采集样品134份,使用PCR和测序的方法筛选blaNDM阳性大肠杆菌,同时对其进行超广谱β-内酰胺酶类基因的检测,采用药敏试验检测blaNDM阳性大肠杆菌... 为了调查江苏地区奶牛场大肠杆菌中blaNDM基因的分子流行病学特征。从江苏部分地区3个奶牛场采集样品134份,使用PCR和测序的方法筛选blaNDM阳性大肠杆菌,同时对其进行超广谱β-内酰胺酶类基因的检测,采用药敏试验检测blaNDM阳性大肠杆菌对19种常用抗生素的敏感性,通过多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对携带NDM基因的大肠杆菌进行亲缘关系分析,通过质粒结合试验验证blaNDM基因的可转移性。结果显示,从134份奶牛场样品中共分离15株blaNDM阳性大肠杆菌,包括NDM-1和NDM-52种变体。15株blaNDM阳性大肠杆菌对多种抗生素均呈现不同程度的耐药,奶牛场15株blaNDM阳性大肠杆菌包括7种ST型,分别是ST410、ST846、ST206、ST101、ST1642、ST3076、ST1626,同一种ST型在粪便样品和环境样品中同时存在,表明相同ST型blaNDM阳性大肠杆菌可在动物与环境间相互传播。PFGE试验结果表明,15株blaNDM阳性大肠杆菌可以分为11个簇,同一样品的分离株倾向于相同的簇,在比较小的范围内存在PFGE图谱相同的现象;对15株菌株的结合子进行blaNDM基因的转移性试验结果表明,15株大肠杆菌的blaNDM耐药基因均通过质粒结合转移至受体菌J53。表明,blaNDM阳性大肠杆菌在江苏省部分地区奶牛场中流行相对较为严重,存在多重耐药现象,推测blaNDM基因主要通过质粒结合转移的方式进行水平传播,这为食品源耐药菌的监测及风险评估提供了依据。 展开更多

关键词 NDM耐药基因 大肠杆菌 多位点序列分型 药敏试验

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可视化-环介导等温扩增技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H 被引量：7

2

作者 夏学峰 张碧成 +2 位作者 王警 张红印 张雪寒 《食品安全质量检测学报》 CAS 2020年第5期1561-1565,共5页

目的建立可视化的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)联合横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)方法检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)0157:H7的分析方法。方法以EHE... 目的建立可视化的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)联合横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)方法检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)0157:H7的分析方法。方法以EHEC 0157:H7的遗传标志性基因z3276基因序列为检测靶标设计6条LAMP特异性引物,其中2条环引物分别标记异硫氰酸荧光素和地高辛,用LFD检测扩增产物,建立EHEC0157:H7 LAMP-LFD检测方法。结果所建立的检测方法能够特异性的检测EHEC 0157:H7,与试验对照菌株EHEC 026、0145、045、0121,及其他主要大肠杆菌血清型025、078、0103、O111、0127、0138、0139、0141,及禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)E058、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)SEC627、EPEC SEC689、K12-MG1655、BL21,和其他种属的受试菌,不存在交叉反应;对EHEC 0157:H7纯培养物的最低检测限为1.3 CFU/mL。结论本研究所建立的LAMP-LFD检测方法特异性和敏感性良好,操作简单,结果可视。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌 z3276基因序列 环介导等温扩增技术 横向流动试纸条

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发酵饲料对樱桃谷肉鸭生长性能和肠道结构的影响 被引量：2

3

作者 张碧成 王玉龙 +2 位作者 于怀华 陈曦 陈哲 《饲料博览》 2023年第4期59-63,共5页

为探讨发酵饲料对樱桃谷肉鸭生长性能和肠道结构的影响,试验选择360只1日龄雄性樱桃谷肉鸭,随机分为3组,每组4个重复,每个重复30只,对照组饲喂基础日粮,试验Ⅰ组和Ⅱ组分别在基础日粮中添加5%和10%发酵饲料,采用两阶段饲喂,试验周期为4... 为探讨发酵饲料对樱桃谷肉鸭生长性能和肠道结构的影响,试验选择360只1日龄雄性樱桃谷肉鸭,随机分为3组,每组4个重复,每个重复30只,对照组饲喂基础日粮,试验Ⅰ组和Ⅱ组分别在基础日粮中添加5%和10%发酵饲料,采用两阶段饲喂,试验周期为42 d。结果表明:试验Ⅰ组平均日增重显著高于对照组(P<0.05),料重比显著低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,试验Ⅰ组十二指肠、回肠、盲肠和直肠长度均有增加(P>0.05),试验组空肠长度均显著高于对照组(P<0.05)。试验Ⅰ组十二指肠、空肠和回肠肠绒毛高度均显著高于对照组(P<0.05),添加发酵饲料增加了隐窝深度,但试验组与对照组差异不显著(P>0.05),绒毛高度/隐窝深度方面,组间差异不显著(P>0.05)。综上,樱桃谷肉鸭日粮中添加5%发酵饲料可显著降低料重比,提高体增重,改善肠道结构,有利于肉鸭健康生长。 展开更多

关键词 发酵饲料 樱桃谷肉鸭 生长性能 肠道结构

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非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对O型口蹄疫病毒的佐剂效果 被引量：4

4

作者 孙小涵 张碧成 +2 位作者 张强 何孔旺 张雪寒 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1714-1722,共9页

【目的】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)的传染性强,传播广,给世界经济和社会发展带来巨大危害,目前疫苗接种仍是主要而有效的防控手段。以增强口蹄疫疫苗免疫效力为目的,基于国内外对鞭毛蛋白佐剂的深入了解与研究,对非致病性大... 【目的】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)的传染性强,传播广,给世界经济和社会发展带来巨大危害,目前疫苗接种仍是主要而有效的防控手段。以增强口蹄疫疫苗免疫效力为目的,基于国内外对鞭毛蛋白佐剂的深入了解与研究,对非致病性大肠杆菌鞭毛进行修饰,研究鞭毛蛋白(flagellin,F)以及有无LTMT佐剂不同重组鞭毛蛋白对口蹄疫病毒(foot and mouth disease virse,FMDV)的佐剂作用。【方法】通过体外表达获得pCold-F0、pCold-F0-LTMT、pCold-F0NC、pCold-F0NC-LTMT 4种不同重组鞭毛蛋白,用间接ELISA方法检测pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT蛋白的生物学活性,按照5μg/只小鼠蛋白量与FMDV灭活抗原混合制备疫苗,同时设置添加或者不添加ISA 206佐剂组,皮下接种Balb/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周。分别于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采血并采集小鼠粪便,45 d后取小肠后段,采用阻断ELISA方法检测血清IgG抗体滴度,用间接ELISA方法检测小鼠粪便和肠洗液中特异的分泌性IgA(secretory IgA,SIgA)抗体滴度,以评估免疫效力。【结果】SDS-PAGE和Western blot分析表明,4种不同重组鞭毛蛋白成功表达。并用GM l-ELISA方法验证了pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT的生物学活性,融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了与GM l结合能力。动物试验结果表明,疫苗经皮下注射接种后,单独口蹄疫抗原组没有产生明显的抗体水平,而鞭毛蛋白佐剂组比单独的口蹄疫抗原组,IgG滴度高,并且产生sIgA抗体滴度更早、更高。此外,LTMT与鞭毛蛋白协同作用能刺激小鼠机体产生更高的IgG和sIgA。在试验中,当鞭毛蛋白与ISA 206佐剂联合使用时,血清中IgG滴度大幅增高,且抗体持续期延长。口蹄疫抗原与ISA 206佐剂和F0NC-LTMT混合使用效果最佳,显示对FMDV的最好保护。【结论】数据表明,黏膜佐剂F0-LTMT发挥双重佐剂活性,皮下注射可显著提高FMDV全身特异性IgG和局部sIgA水� 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 非致病性大肠杆菌 鞭毛蛋白 佐剂

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遗传标志性基因Z0372 PCR检测肠出血大肠杆菌O157:H7 被引量：3

5

作者 张雪寒 张碧成 +3 位作者 栾晓婷 汪伟 周俊明 何孔旺 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第1期409-413,共5页

肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC）O157：H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157：H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分... 肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC）O157：H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157：H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分析敏感性、特异性,并检测模拟阳性污染样品。结果表明,Z0372-PCR对纯培养物检测限103~104CFU/m L,模拟阳性污水样和肉样,增菌后检测限10~102CFU/m L（g）。非大肠杆菌O157和其他肠道病原全部为阴性扩增,只有肠出血性大肠杆菌O157：H7扩增出清晰而特异的条带。模拟阳性样品检测,条带特异,无任何杂带,测序与Gen Bank序列高度同源。因此,Z0372-PCR是特异性检测肠出血性大肠杆菌O157：H7的技术,操作简便,成本低廉,适合实验室肠道内容物、刮取物、污水和食品等的快速检测。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157:H7 Z0372 聚合酶链反应 食品 排泄物

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肝片吸虫Fh8明显增强STEC的Stx1可溶性表达及Stx1单克隆抗体制备 被引量：2

6

作者 张雪寒 张碧成 +2 位作者 张强 汪伟 何孔旺 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第5期44-49,共6页

志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）,系五聚体蛋白,是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli,STEC）主要的毒素因子,但Stx1体外极不易可溶性表达,旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）A亚基,体外获得... 志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）,系五聚体蛋白,是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli,STEC）主要的毒素因子,但Stx1体外极不易可溶性表达,旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）A亚基,体外获得可溶性表达的Stx1,以研制单克隆抗体。生物信息学软件分析Stx1A亚基氨基酸序列,Stx1A1亚基N端为信号肽段,其C端高疏水性和低免疫原性。PCR扩增stx1A亚基73~759的687个核苷酸,与肝片吸虫Fh8基因串联,克隆到低温表达载体p ColdⅠ以构建重组菌,诱导表达重组毒素His-Fh8-Stx1A,SDS-PAGE分析蛋白表达形式。重组毒素His-Fh8-Stx1A免疫Balb/c小鼠,Sp2/0细胞融合筛选、制备阳性杂交瘤和单克隆抗体。PCR扩增Fh8和stx1a亚基并构建重组质粒p ColdⅠ-His-Fh8-stx1,重组蛋白在原核细胞中得到高效表达,且以可溶性形式存在于菌体胞浆中。以重组His-Fh8-Stx1A为免疫原,成功制备3株能稳定传代并分泌Stx1的单克隆抗体（Mc Ab）的杂交瘤细胞株,取其中1株成功制备高ELISA效价的腹水。Western Blot显示,纯化的单克隆抗体可与重组免疫原His-Stx1A和天然志贺毒素1发生特异性反应。本试验成功可溶性表达志贺毒素1A亚基,并获得多株单克隆抗体,为研制用于检测STEC的夹心ELISA和胶体金试纸条奠定理论基础。 展开更多

关键词 产志贺毒素大肠杆菌 志贺毒素1 肝片吸虫 Fh8 可溶性表达 单克隆抗体

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鲜奶中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的定量PCR检测 被引量：2

7

作者 俞正玉 张碧成 +7 位作者 张强 汪伟 何孔旺 倪艳秀 温立斌 李彬 周萍 张雪寒 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第5期1173-1178,共6页

为建立鲜奶中肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的特异性检测方法,以EHEC O157∶H7独有的遗传标志性基因Z0372为靶序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有Z0372基因的重组质粒作为标准品进行Taqman荧光定量PCR反... 为建立鲜奶中肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的特异性检测方法,以EHEC O157∶H7独有的遗传标志性基因Z0372为靶序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有Z0372基因的重组质粒作为标准品进行Taqman荧光定量PCR反应,分析该方法的敏感性、特异性,并检测鲜奶样品以验证Taqman荧光定量PCR实用性和可靠性。结果表明,建立的定量PCR方法在1μl 1×101拷贝至1μl 1×106拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.996,扩增效率112%。该方法的检测灵敏度为1μl 70拷贝,敏感性较高,而且特异性良好,与其他血清型大肠杆菌、沙门氏杆菌和志贺氏菌等易混淆菌株核酸之间没有交叉反应。批间和批内检测的变异系数(RSD)低于2%,表明该方法重复性良好。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 荧光定量PCR 鲜奶

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检测产志贺毒素大肠杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的研制 被引量：2

8

作者 张雪寒 张强 +7 位作者 张碧成 汪伟 倪艳秀 温立斌 李彬 周俊明 何孔旺 周萍 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第11期2738-2745,共8页

本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ELISA技术,检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxigenic Escherichia coli,STEC）的抗体水平。根据紧密素27个亚型的N端保守序列,体外表达390-543 aa片段制备包被抗原,通过敏感性、特异... 本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ELISA技术,检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxigenic Escherichia coli,STEC）的抗体水平。根据紧密素27个亚型的N端保守序列,体外表达390-543 aa片段制备包被抗原,通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验,建立检测STEC的抗体的间接EIISA方法。经优化筛选的间接ELISA最佳反应条件：抗原包被浓度3 ng/孔,待检血清稀释比例1∶200,HRP-兔抗羊Ig G、HRP-兔抗牛Ig G的工作浓度均为1∶15000,5%脱脂奶封闭l h,底物作用时间10min,用于牛、羊疫苗抗体检测或者STEC大肠杆菌感染的监测。 展开更多

关键词 致病性大肠杆菌 紧密素 间接ELISA

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多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌的4个血清型 被引量：2

9

作者 王警 张碧成 +3 位作者 郭芸芸 吴庆侠 何孔旺 张雪寒 《食品安全质量检测学报》 CAS 2019年第2期440-446,共7页

目的建立多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)主要血清型O26、O145、O45和O121的分析方法。方法根据GenBank登录序列,设计扩增O抗原翻转酶(wzx)基因的引物,建立PCR方法,并以STECO26、O145... 目的建立多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)主要血清型O26、O145、O45和O121的分析方法。方法根据GenBank登录序列,设计扩增O抗原翻转酶(wzx)基因的引物,建立PCR方法,并以STECO26、O145、O45和O121基因组为模板,检验多重PCR的灵敏度和特异性。使用建立的PCR,检测牛胴体表面拭子,阳性扩增条带送测序,以验证PCR扩增的可靠性。同时将阳性扩增样品,涂布显色平板,分离靶标血清型细菌。结果本研究成功建立STEC O26、O145、O45和O121的多重PCR方法, PCR循环参数中退火温度为60℃,扩增片段分别为249、353、890和587 bp。多重PCR直接检测O26、O145、O45和O121时,最低检测限介于10~3～10~4 CFU/mL,而增菌后再检测,最低检测限均为1CFU/m L。多重PCR用于其他血清型STEC,和非大肠杆菌扩增时,均未扩增出目的条带,只有O26、O145、O45和O121能够扩增出相应条带。当使用多重PCR直接检测胴体擦拭子时,阳性率为5.45%(3/55),主要为O26、O145血清型;增菌后检测阳性率为7.27%(4/55),主要为O26、O145和O121血清型。阳性PCR扩增样品,成功分离到O26两株、O145和O121各一株。分离菌株具有典型大肠杆菌的生化特性,携带STEC代表性毒力因子志贺毒素和紧密素,且具有多重耐药性。结论以STECO26、O145、O45和O121的wzx基因为检测靶标,成功建立多重PCR方法,灵敏度和特异性良好,与细菌分离联合使用,可减少工作量,精准分离目的病原菌。 展开更多

关键词 产志贺毒素性大肠杆菌 多聚酶链反应 胴体 耐药

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发酵豆粕对黑猪哺乳仔猪生长性能的影响 被引量：2

10

作者 王玉龙 高升 +3 位作者 涂枫 张碧成 张峰 陈哲 《饲料博览》 CAS 2022年第3期44-47,共4页

为了研究发酵豆粕对黑猪哺乳仔猪生长性能的影响,试验选择5日龄黑猪补乳仔猪144头,按照窝别、体重相近的原则分为对照组和试验组,每组3个重复,每个重复24头仔猪,分别饲喂由普通豆粕、发酵豆粕制成的教槽饲料。结果表明:发酵豆粕抗原蛋... 为了研究发酵豆粕对黑猪哺乳仔猪生长性能的影响,试验选择5日龄黑猪补乳仔猪144头,按照窝别、体重相近的原则分为对照组和试验组,每组3个重复,每个重复24头仔猪,分别饲喂由普通豆粕、发酵豆粕制成的教槽饲料。结果表明:发酵豆粕抗原蛋白降解较为彻底;24日龄仔猪断奶重差异不显著(P>0.05),但试验组比对照组提高了4.25%;对照组和试验组15~24日龄平均日采食量差异显著(P<0.05),试验组比对照组提高了11.70%;整个正式试验期,试验组饲料消耗量显著高于对照组(P<0.05),试验组比对照组提高10.98%;试验组腹泻率和死亡率均低于对照组,分别降低了22.93%、49.40%。 展开更多

关键词 发酵豆粕 黑猪哺乳仔猪 生长性能 腹泻率

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Fh8明显增强PCV2 Cap蛋白的可溶性表达及抗原性 被引量：1

11

作者 郭芸芸 张碧成 +4 位作者 孙小涵 汪伟 何孔旺 牛家强 张雪寒 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期356-360,共5页

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的主要功能蛋白Cap蛋白,很难在体外获得可溶性表达。本研究旨在以Fh8蛋白为融合标签实现PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的可溶性表达,以小鼠评价可溶性Cap蛋白的抗原性。以病毒基因组为模板,... 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的主要功能蛋白Cap蛋白,很难在体外获得可溶性表达。本研究旨在以Fh8蛋白为融合标签实现PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的可溶性表达,以小鼠评价可溶性Cap蛋白的抗原性。以病毒基因组为模板,扩增ORF2靶基因,插入p Cold原核表达质粒,成功构建的p Cold-ORF2阳性质粒转入大肠杆菌BL21中。利用SDS-PAGE分析Cap蛋白的可溶性表达情况,利用Western blotting鉴定Cap蛋白的反应原性。重组蛋白与佐剂乳化制备免疫原,免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中Cap抗体,利用PCR检测组织脏器中病毒载量,以评估可溶性Cap蛋白的免疫原性。PCR结果表明,Fh8和PCV2 ORF2基因被成功扩增。SDS-PAGE结果表明Fh8标签显著提高了ORF2在大肠杆菌中的可溶性表达,分子量35 000。Western blotting结果显示,猪PCV2阳性血清能够特异性的识别可溶性Cap蛋白。小鼠一次接种Cap蛋白28 d后,抗体全部转阳,免于PCV2的攻击。表明通过新型小标签实现了PCV2 ORF2基因的可溶性表达,且具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 结构蛋白 Fh8 可溶性表达 抗原性

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大鼠血管内皮细胞的分离、鉴定及传代培养

12

作者 高瑞金 刘学 +4 位作者 崔卫波 谭海明 张碧成 陆倩倩 张雨梅 《山东畜牧兽医》 2013年第4期8-10,共3页

为了获取大鼠血管内皮细胞供血管形成研究,建立了大鼠主动脉内皮细胞的分离培养方法。采用Wister大鼠主动脉植块法分离内皮细胞并传代培养,计数并绘制不同代次内皮细胞生长曲线。应用CD31免疫组化及内皮细胞的管形成试验对内皮细胞进行... 为了获取大鼠血管内皮细胞供血管形成研究,建立了大鼠主动脉内皮细胞的分离培养方法。采用Wister大鼠主动脉植块法分离内皮细胞并传代培养,计数并绘制不同代次内皮细胞生长曲线。应用CD31免疫组化及内皮细胞的管形成试验对内皮细胞进行了鉴定。结果表明,主动脉植块法及传代培养获得的细胞具有内皮细胞"铺路石"样的典型特性,传代生长状态良好;CD31抗体免疫组化阳性、管形成能力良好。所建立的大鼠主动脉植块法分离及体外培养内皮细胞的体系是一种简便可行的获取内皮细胞的有效方法。 展开更多

关键词 血管内皮细胞 分离培养 大鼠主动脉

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类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)基因表达及间接ELISA方法的建立

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作者 王警 张雪寒 +3 位作者 郭芸芸 张碧成 吴庆侠 何孔旺 《畜牧兽医科学（电子版）》 2019年第8期5-6,共2页

试验针对产类志贺毒素大肠杆菌SLT-IIe初步建立一种猪水肿病大肠杆菌的血清学检测方法。通过原核表达构建出重组菌pET28a-sumo-SLT-IIe/BL21在IPTG诱导下获得表达,表达产物以包涵体形式产生,使用十二烷基肌氨酸钠(SKL)变性的生化提纯步... 试验针对产类志贺毒素大肠杆菌SLT-IIe初步建立一种猪水肿病大肠杆菌的血清学检测方法。通过原核表达构建出重组菌pET28a-sumo-SLT-IIe/BL21在IPTG诱导下获得表达,表达产物以包涵体形式产生,使用十二烷基肌氨酸钠(SKL)变性的生化提纯步骤获取有生物学活性的重组蛋白。将提取的SLT-IIe蛋白作为抗原包被ELISA板,初步建立了特异性强的猪水肿病诊断方法,方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为2μg/孔,最佳血清稀释浓度是l∶25,HRP-羊抗猪二抗的工作浓度1∶15000,5%脱脂奶封闭lh,显色15min。该方法的建立对猪水肿病流行病学调查以及预防和控制该病的发生有重要意义。 展开更多

关键词 猪水肿病 产类志贺毒素大肠杆菌 SLT-IIE ELISA

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肝片吸虫Fh8标签融合表达口蹄疫O型病毒结构蛋白

14

作者 孙小涵 张雪寒 +2 位作者 张碧成 张强 何孔旺 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期727-730,共4页

口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）的结构蛋白VP1难以实现体外的高效表达。本研究为获得良好免疫原性的VP1蛋白，选用肝片吸虫Fh8小肽段作为新型融合表达标签，构建重组Fh8-VP1免疫原，以期获得大肠杆菌中的高效表达。... 口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）的结构蛋白VP1难以实现体外的高效表达。本研究为获得良好免疫原性的VP1蛋白，选用肝片吸虫Fh8小肽段作为新型融合表达标签，构建重组Fh8-VP1免疫原，以期获得大肠杆菌中的高效表达。分别合成VP1的20440aa和129～169aa之间的核苷酸片段，并用2个甘氨酸（GG）连接2个片段，合成的核苷酸片段（△VP1）克隆入Fh8标签之后，构建重组菌BL21（DE3）／pCold I—Fh8-△VP1，SDS-PAGE分析蛋白表达形式，Westernblot方法检测重组His—Fh8-△VP1的抗原性。结果显示，成功构建重组质粒BL21（DE3）／pCold I—Fh8-△VP1，并在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达，且以包涵体形式存在于菌体蛋白，可与猪源FMDV阳性血清发生特异性反应。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 VP1 肝片吸虫Fh8 可溶性表达

原文传递

非致病大肠杆菌鞭毛与O型FMDV结构蛋白VP1嵌合体的免疫效力评估

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作者 葛东红 孙小涵 +3 位作者 郭芸芸 张碧成 王警 张雪寒 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第12期96-99,共4页

为探讨以非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白为载体展示口蹄疫病毒(FMDV) VP1蛋白嵌合体(Fn-VP1-Fc)的免疫效力为目的,筛选2月龄FMDV阴性仔猪,颈部肌肉注射,分别于免疫前、免疫后第14、28和60天采集血清,用液相阻断ELISA (LPB-ELISA)测定IgG滴度... 为探讨以非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白为载体展示口蹄疫病毒(FMDV) VP1蛋白嵌合体(Fn-VP1-Fc)的免疫效力为目的,筛选2月龄FMDV阴性仔猪,颈部肌肉注射,分别于免疫前、免疫后第14、28和60天采集血清,用液相阻断ELISA (LPB-ELISA)测定IgG滴度。分别于免疫前和免疫后第28天,采集鼻腔拭子和肛拭子,间接ELISA测定IgA滴度。结果显示,疫苗接种第14天,免疫Fn-VP1-Fc疫苗产生了可以检测到的FMDV特异性抗体;第28和60天,FMDV特异性抗体持续升高;第60天,产生了可以检测到的特异性IgA,部分猪只滴度可达1∶160,而对照疫苗未检测到IgA。结果表明,Fn-VP1-Fc嵌合免疫原不仅能促进FMDV全身特异性抗体产生,也在一定程度上促进局部IgA分泌。 展开更多

关键词 大肠杆菌鞭毛 口蹄疫病毒 VP1 免疫原性 猪

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江苏地区屠宰场大肠杆菌O157:H7的分子流行病学研究

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作者 张碧成 夏学峰 张雪寒 《畜牧业环境》 2022年第23期71-73,共3页

本研究用多重PCR检测44株大肠杆菌O157:H7的主要毒力基因,使用多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳两种分型技术鉴定菌株之间亲缘关系,自动化仪器测定病原菌对常用抗生素的敏感性。结果表明,44株大肠杆菌O157:H7的毒力因子stx1、stx2、hly和... 本研究用多重PCR检测44株大肠杆菌O157:H7的主要毒力基因,使用多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳两种分型技术鉴定菌株之间亲缘关系,自动化仪器测定病原菌对常用抗生素的敏感性。结果表明,44株大肠杆菌O157:H7的毒力因子stx1、stx2、hly和eae检出率分别为59.09%、93.18%、75.00%和100%,共分为6个毒力基因表型;多位点序列分型研究发现所有菌株分属3个ST型,分别为ST11、ST4429和ST1423,其中ST11为优势型。脉冲场凝胶电泳聚类分析将所有菌株分成19个PT型,具有显著多态性。44株O157:H7对14种常用兽用抗生素具有不同程度的耐药性,其中对氨苄西林、磺胺异恶唑、链霉素和阿奇霉素强耐药。 展开更多

关键词 大肠杆菌 O157:H7 毒力基因 分子流行病学

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鸡Ⅰ群禽腺病毒病的诊断与防控

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作者 魏若瑶 张碧成 高升 《畜牧业环境》 2022年第21期51-52,共2页

Ⅰ群禽腺病毒病是一种传播快、发病急、死亡高的病毒性疾病。该病毒1987年首次出现在巴基斯坦,2015年首次在我国报道。随着养殖场规模化发展,鸡只发病率逐渐增高,且至今市面上鲜见针对该病毒的特效治疗药物。文章首先分析鸡Ⅰ群禽腺病... Ⅰ群禽腺病毒病是一种传播快、发病急、死亡高的病毒性疾病。该病毒1987年首次出现在巴基斯坦,2015年首次在我国报道。随着养殖场规模化发展,鸡只发病率逐渐增高,且至今市面上鲜见针对该病毒的特效治疗药物。文章首先分析鸡Ⅰ群禽腺病毒病的流行病学,然后从临床症状、病理变化、诊断要点三个方面分析了鸡Ⅰ群禽腺病毒病的初步诊断方法,最后归纳总结了相应的防控措施,并对下一步研究方向和疫苗、卵黄抗体研发提出建议。 展开更多

关键词 鸡Ⅰ群禽腺病毒病 诊断 防控

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谈民族地区农村集体资金的提留问题

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作者 尤琦 张碧成 《西南民族大学学报（人文社会科学版）》 CSSCI 北大核心 1990年第6期28-30,共3页

农村提留是指农民除按税法向国家缴纳税金外,向乡村集体上交的提留和统筹费。其性质是乡村集体资金,其目的是用于增加集体公共积累,发展农村经济,它主要包括公积金、公益金和管理费。要发展农村社会化大生产,必须有一定资金投入,目前比... 农村提留是指农民除按税法向国家缴纳税金外,向乡村集体上交的提留和统筹费。其性质是乡村集体资金,其目的是用于增加集体公共积累,发展农村经济,它主要包括公积金、公益金和管理费。要发展农村社会化大生产,必须有一定资金投入,目前比较可行的方法之一就是积极兴办农村合作经济,以农村合作基金会的组织方式来体现。农村基金会可以协调农业生产中的产前。 展开更多

关键词 集体资金 民族地区农村 集体提留 农民 发展农村经济 提留款 集体经济 公积金 土地承包费 农业生产投入

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地铁车站结构防水施工处理技术应用分析

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作者 张碧成 《中文科技期刊数据库（全文版）工程技术》 2021年第1期190-190,192,共2页

地铁车站是地铁工程中非常关键的一个部分,地铁车站的整体结构和功能直接关系着人们使用地铁的真实感受。而渗漏水则是地铁车站主体结构施工中常见的问题,如果不将渗漏水处理好,它会对地铁车站的使用造成严重的影响,还会带给人们不好的... 地铁车站是地铁工程中非常关键的一个部分,地铁车站的整体结构和功能直接关系着人们使用地铁的真实感受。而渗漏水则是地铁车站主体结构施工中常见的问题,如果不将渗漏水处理好,它会对地铁车站的使用造成严重的影响,还会带给人们不好的体验感受。基于此,文章就地铁车站结构防水施工处理技术应用展开论述。 展开更多

关键词 地铁车站 结构防水 处理技术

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大肠杆菌O157∶H7独有基因z3276的表达及初步鉴定 被引量：2

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作者 张碧成 张雪寒 +1 位作者 何孔旺 范红结 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1354-1357,共4页

经BLAST分析表明,开放阅读框z3276是大肠杆菌O157∶H7独有的遗传标志性基因,编码氨基酸与大肠杆菌Ⅰ型菌毛有较高的同源性,但z3276基因编码蛋白的生物学特性尚不明确。为了明确z3276基因编码蛋白的抗原性,进一步研究其在大肠杆菌O157∶H... 经BLAST分析表明,开放阅读框z3276是大肠杆菌O157∶H7独有的遗传标志性基因,编码氨基酸与大肠杆菌Ⅰ型菌毛有较高的同源性,但z3276基因编码蛋白的生物学特性尚不明确。为了明确z3276基因编码蛋白的抗原性,进一步研究其在大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用。采用PCR方法扩增z3276基因,去除其信号肽序列,克隆到原核表达载体pColdⅠ,转化感受态细胞BL21获得阳性重组菌,IPTG诱导表达重组蛋白,以大肠杆菌O157∶H7全菌抗血清为一抗,Western blot方法检测重组z3276蛋白抗原性。结果显示,成功构建重组菌BL21(pColdⅠ-z3276),并获得高效表达;相对分子质量33 000,占菌体总蛋白30%以上,主要以包涵体形式存在于菌体沉淀中;且与兔源全菌多克隆抗血清发生特异性反应,条带明显。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157:H7 标签基因 z3276基因 原核表达

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