人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达 被引量：6

1

作者 刘荣 姜文国 +5 位作者 刘芳 张砚君 范冬梅 杨铭 熊冬生 杨纯正 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期543-545,549,共4页

目的:构建和表达人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并测定该融合蛋白的生物学活性。方法:采用PCR和ovelap PCR方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用150g/L SDS-... 目的:构建和表达人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并测定该融合蛋白的生物学活性。方法:采用PCR和ovelap PCR方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用150g/L SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产物;采用FACS法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果:DNA序列测定结果表明:人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白已构建成功,表达可溶性产物的产量达4mg/L以上,具有与Raji细胞(CD20+)和A549(4-1BB+)细胞结合的活性。结论:利用融合蛋白形式,首次成功地构建了人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白,并获得较高表达。表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。 展开更多

关键词 4-1BBL CD20 融合蛋白 免疫治疗

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人脐带来源间充质干细胞向HepG2肝癌细胞原位移植瘤的归巢及分化 被引量：7

2

作者 范冬梅 张子祥 +5 位作者 赵英新 杨铭 张砚君 颜次慧 蒋媛 吕军强 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期595-600,共6页

目的:观察人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,HUMSC)向HepG2肝癌细胞原位移植瘤的归巢及分化。方法:二步法体外诱导HUMSC向肝细胞分化,通过Real-time PCR和Western blotting检测不同时间点H... 目的:观察人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,HUMSC)向HepG2肝癌细胞原位移植瘤的归巢及分化。方法:二步法体外诱导HUMSC向肝细胞分化,通过Real-time PCR和Western blotting检测不同时间点HUMSC中肝细胞特异性基因甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)及白蛋白(albumin,ALB)mRNA和蛋白水平的变化;Transwell实验观察HUMSC在HepG2肝癌细胞条件培养基作用下的趋化现象;采用皮下-原位移植的方法建立BALB/c裸鼠的HepG2肝癌细胞原位移植瘤模型,利用慢病毒感染的方法将HUMSC标记CMV或AFP启动子驱动的f Luc,制备成MSC.CMVLuc或MSC.AFPLuc,并将其注射入荷瘤肝组织,IVIS成像系统观察MSC.CMVLuc向肿瘤部位的迁移归巢及MSC.AFPLuc在肝癌微环境中向肝细胞分化。结果:HUMSC在体外诱导培养过程中出现细胞形态学变化证明其向肝细胞分化,同时诱导培养后AFP、ALB mRNA和蛋白的表达明显升高(均P<0.05);HUMSC向HepG2肝癌细胞的趋化呈瘤细胞密度依赖性(P<0.01);MSC.CMVLuc注射后2 d迁移并聚集于肝脏,注射后5 d肝脏内发光信号进一步增强;MSC.AFPLuc肝内注射后24 h已向肝细胞分化,注射第7天AFP启动子活性最强,注射第9天活性消失。结论:在小鼠体内外证明了HUMSC具有向肝脏归巢及分化的能力,为今后MSC应用于肝癌基因靶向治疗提供了一种新的策略。 展开更多

关键词 间充质干细胞 肝癌 归巢 分化

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靶向白血病干细胞CD123的毒性融合蛋白的制备 被引量：6

3

作者 任思楣 张砚君 +5 位作者 彭洪薇 王金宏 纪庆 范冬梅 张楠 曾洁 《白血病．淋巴瘤》 CAS 2011年第8期490-493,共4页

目的构建靶向白血病干细胞CD123的融合蛋白，检测其表达效果及其识别白血病干细胞的活性。方法采用PCR法扩增白细胞介素-3（IL-3）和毒素蛋白（LP）的编码DNA序列，经酶切、连接，克隆至表达载体pAYZ，转化大肠杆菌E-coli 16C9，鉴定阳... 目的构建靶向白血病干细胞CD123的融合蛋白，检测其表达效果及其识别白血病干细胞的活性。方法采用PCR法扩增白细胞介素-3（IL-3）和毒素蛋白（LP）的编码DNA序列，经酶切、连接，克隆至表达载体pAYZ，转化大肠杆菌E-coli 16C9，鉴定阳性克隆菌落，经低磷培养基AP5诱导表达融合蛋白IL-3-G4S．LP，用CM—FF阳离子柱和抗-Etag亲和层析柱纯化，纯化产物经SDS—PAGE和Western blot鉴定，流式细胞术测定其与红白血病细胞TFl的结合活性。结果构建的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶性蛋白表达，纯化后纯度达95％以上，表达量约为1mg／L，并有与白血病干细胞表面IL-3受体d亚基（CD123）特异性结合的活性。结论构建的融合蛋白IL-3-G4S—LP具有与白血病干细胞结合的特性，可望成为复发和耐药白血病的治疗药物。 展开更多

关键词 融合蛋白 白细胞介素3 肿瘤干细胞 靶向治疗

原文传递

过表达的细胞膜表面角蛋白8——乳腺癌多药耐药的一种新靶点 被引量：4

4

作者 刘芳 高瀛岱 +5 位作者 郭红星 张砚君 代晓华 师锐赞 杨纯正 熊冬生 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1441-1444,共4页

目的研究细胞膜角蛋白8(CK8)过表达与乳腺癌多药耐药的相关性及其作为逆转乳腺癌耐药靶点的可行性。方法转染特异的CK8-siRNAs至人乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX,用Western blot方法检测siRNAs对CK8蛋白表达的抑制,荧光染色用激光共聚焦显微... 目的研究细胞膜角蛋白8(CK8)过表达与乳腺癌多药耐药的相关性及其作为逆转乳腺癌耐药靶点的可行性。方法转染特异的CK8-siRNAs至人乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX,用Western blot方法检测siRNAs对CK8蛋白表达的抑制,荧光染色用激光共聚焦显微镜观察细胞膜表面CK8表达量的改变,并用Sulforhodamine B的方法检测转染前后细胞对多种化疗药敏感性的变化。结果MCF-7/MX细胞导入CK8-siRNAs后,细胞膜CK8的表达水平明显抑制,同时对米托蒽醌等化疗药的敏感性明显提高,耐药表型明显逆转。结论CK8细胞内定位及表达水平的改变,在乳腺癌多药耐药表型的形成中起重要作用。作为一种新的耐药相关膜表面标志,细胞膜CK8有望成为逆转乳腺癌多药耐药诊断和治疗的新靶点。 展开更多

关键词 多药耐药 细胞膜角蛋白8 靶点 RNAI 乳腺癌

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干扰α烯醇化酶对耐药细胞株K562/A02耐药性的影响 被引量：4

5

作者 高雪 叶舟 +4 位作者 吴克雄 范冬梅 杨铭 张砚君 张益枝 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1521-1526,共6页

目的肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,α烯醇化酶(eno1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关。探究eno1对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02生长及耐药的影响。方法筛选3株稳定干扰eno1的细胞系K562/A02-sheno1和对照细胞... 目的肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,α烯醇化酶(eno1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关。探究eno1对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02生长及耐药的影响。方法筛选3株稳定干扰eno1的细胞系K562/A02-sheno1和对照细胞系K562/A02-shcon;采用细胞计数法测定细胞生长速率,MTT法测定细胞增殖能力,细胞内罗丹明123含量测定细胞外排药物能力,real-time PCR反应测定基因mRNA表达水平,Western blot实验测定基因蛋白表达水平。结果与敏感性细胞株K562相比,eno1在耐药细胞株K562/A02中为高表达状态,其在mRNA水平和蛋白水平表达分别增高(2.85±0.56)倍和(1.43±0.05)倍;而K562/A02细胞生长速率与K562细胞相比差异无显著性。K562/A02-sheno1细胞系与对照组K562/A02-shcon相比生长速率降低,对抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增强,且K562/A02-sheno1细胞系中罗丹明123含量也明显增高。K562/A02-sheno1细胞系中耐药相关基因MDR1表达水平降低。结论稳定干扰eno1表达能抑制K562/A02细胞生长,有效逆转K562/A02细胞耐药性,提高其对药物的敏感性,其机制与MDR1基因表达相关。 展开更多

关键词 人慢性粒细胞白血病 肿瘤耐药 K562/A02 细胞生长 eno1 MDR1

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幼儿心功能测评方法的试验研究 被引量：4

6

作者 王佩云 张一兵 张砚君 《天津体育学院学报》 CAS CSSCI 北大核心 2003年第2期78-79,共2页

为了确定幼儿心功能测评方法,选择了3种不同的运动负荷量,即“30s30次蹲起”、“30s20次蹲起”、“45s30次蹲起”,对1412名3～6岁幼儿进行实验、对比发现,处于发育期的幼儿不宜进行大强度负荷的运动实验,静态的心率、血压测评也难以对... 为了确定幼儿心功能测评方法,选择了3种不同的运动负荷量,即“30s30次蹲起”、“30s20次蹲起”、“45s30次蹲起”,对1412名3～6岁幼儿进行实验、对比发现,处于发育期的幼儿不宜进行大强度负荷的运动实验,静态的心率、血压测评也难以对心血管功能作出有效的评定。因此,最终确定以“45s30次蹲起”的定量负荷测评作为该年龄阶段心功能评价科学、有效、简便易行的方法。 展开更多

关键词 幼儿 心功能 蹲起负荷

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PHⅡ-7对人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR体外杀伤活性和逆转耐药作用 被引量：3

7

作者 师锐赞 张秀丽 +7 位作者 杨铭 张砚君 彭洪薇 任思楣 林阳 刘荣 李崴 熊冬生 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期321-326,共6页

背景与目的:多药耐药(multidrug resistance,MDR)是恶性乳腺癌化疗失败的主要原因,而ABC转运蛋白家族的P-glycoprotein(P-gp)高表达是MDR的主要机制之一。因此研制能抑制P-gp表达及其功能的新型抗癌药是目前研究的热点。本研究旨在研究P... 背景与目的:多药耐药(multidrug resistance,MDR)是恶性乳腺癌化疗失败的主要原因,而ABC转运蛋白家族的P-glycoprotein(P-gp)高表达是MDR的主要机制之一。因此研制能抑制P-gp表达及其功能的新型抗癌药是目前研究的热点。本研究旨在研究PHⅡ-7对人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR体外抗瘤活性及逆转耐药的作用。方法:采用MTT法检测PHⅡ-7、多柔比星(adriamycin,ADR)及二者联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7和耐药细胞株MCF-7/ADR的IC50值;采用流式细胞仪测定PHⅡ-7对MCF-7及MCF-7/ADR细胞凋亡的诱导作用;采用逆转录PCR和实时荧光定量PCR方法检测PHⅡ-7对多药耐药基因1(multidrug resistance gene1,mdr1)表达水平的影响;通过流式细胞仪观察PHⅡ-7处理前后,MCF-7/ADR细胞内Rhodamine123浓度的改变,分析PHⅡ-7对P-gp外排功能的影响。结果:PHⅡ-7对MCF-7和MCF-7/ADR细胞均有生长抑制作用,IC50值分别为(6.07±0.85)和(5.51±1.22)μmol/L;低浓度PHⅡ-7与ADR联合应用能增强其细胞毒作用,二者具有协同作用。PHⅡ-7可诱导MCF-7和MCF-7/ADR细胞凋亡;在诱导凋亡过程中,PHⅡ-7可降低MCF-7/ADR细胞内mdr1基因的表达,抑制P-gp外排功能。结论:PHⅡ-7可诱导MCF-7/ADR凋亡,并具有对MCF-7相同的体外杀伤活性。PHⅡ-7可通过抑制P-gp的表达和功能逆转MCF-7/ADR耐药性。 展开更多

关键词 PHⅡ-7 多药耐药 mdr1 P-GP 逆转耐药

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IL-3-LDM融合蛋白对CD123^＋白血病细胞的靶向杀伤作用 被引量：3

8

作者 张砚君 李双静 +8 位作者 姜琳琳 刘荣 高雪 袁向飞 齐怀丰 范冬梅 苗庆芳 甄永苏 熊冬生 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期391-397,共7页

目的:构建以IL-3为靶向、力达霉素(lidamycin,LDM)为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。方法:原核表达IL-3-LDP(interleukin 3-lidamycin)融合蛋白,组装活性烯二炔(active enediyne,AE)发色团得到IL-... 目的:构建以IL-3为靶向、力达霉素(lidamycin,LDM)为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。方法:原核表达IL-3-LDP(interleukin 3-lidamycin)融合蛋白,组装活性烯二炔(active enediyne,AE)发色团得到IL-3-LDM。流式细胞术检测不同白血病细胞系(KG1-a、TF-1、M07e、HL-60、K562、Raji)表面CD123分子的表达,并检测融合蛋白IL-3-LDM与各白血病细胞的结合能力;CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白对不同CD123阳性率的白血病细胞的杀伤能力。结果:组装活性发色团得到的IL-3-LDM蛋白纯度可达90%以上。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)KG-1a细胞表面CD123阳性率最高(88.9%),其次为MO7e和TF-1细胞(>75%),再次为HL-60细胞(7.8%),而K562、Raji细胞CD123表达呈阴性。体外IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞(KG-1a、MO7e、TF-1和HL-60细胞)的结合能力和杀伤效率与细胞表面CD123的阳性率成正比,对于CD123表达率最高的KG-1a细胞,LDM的杀伤强度是多柔比星(adriamycin,ADR)的1 415.8倍,而IL-3-LDM的杀伤强度又是LDM的9.6倍。结论:IL-3-LDM融合蛋白可以有效携带细胞毒药物LDM并高效靶向杀伤CD123+白血病细胞。 展开更多

关键词 IL-3 力达霉素 融合蛋白 CD123 白血病 肿瘤干细胞

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消减免疫法制备抗HL60、HL60/ADR表面抗原差异抗体 被引量：4

9

作者 任思楣 俞云 +7 位作者 佘鸣 邵晓枫 师锐赞 彭洪薇 林阳 张秀丽 张砚君 熊冬生 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期160-163,共4页

目的:建立可特异识别HL60和HL60/ADR细胞膜表面差异蛋白的抗体库,制备单克隆抗体并研究其生物学活性。方法:通过Cp诱导的消减免疫法免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备可特异识别两种细胞差异膜蛋白的单克隆抗体;采用FACS和激光共... 目的:建立可特异识别HL60和HL60/ADR细胞膜表面差异蛋白的抗体库,制备单克隆抗体并研究其生物学活性。方法:通过Cp诱导的消减免疫法免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备可特异识别两种细胞差异膜蛋白的单克隆抗体;采用FACS和激光共聚焦显微镜鉴定其和两种靶细胞结合的特异性和差异性。结果:获得51株候选的差异抗体,成功筛选并纯化其中一株单抗(5F6)。5F6与可特异稳定的识别HL60/ADR细胞,结合率扣除本底为68.2%,而该抗体与HL60细胞的结合率为17%。结论:SI结合差异筛选的方法是制备差异抗体便捷可行的方法,所获得的单克隆抗体与HL60和HL60/ADR细胞膜蛋白结合有特异性和差异性,实验中所获得的单抗是寻找肿瘤耐药的新靶点和发现肿瘤耐药新机制的工具,为研究这些问题开拓了新思路。 展开更多

关键词 消减免疫 肿瘤耐药 单克隆抗体 差异识别

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脐带间充质干细胞运载scFvCD20：sTRAIL融合蛋白对B-淋巴瘤细胞的生长抑制作用 被引量：2

10

作者 范冬梅 张晓龙 +5 位作者 张晴 卢杨 杨圆圆 袁向飞 张砚君 熊冬生 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期939-944,共6页

目的:探讨脐带间充质干细胞运载scFvCD20:s TRAIL融合蛋白的新型双重靶向系统对CD20+BJAB细胞的生长抑制作用。方法:采用传统分子生物学技术构建p LenR.sc FvCD20:s TRAIL、p LenR.ISZ-s TRAIL、p LenR.sc Fv CD20及p LenR.cop GFP四种... 目的:探讨脐带间充质干细胞运载scFvCD20:s TRAIL融合蛋白的新型双重靶向系统对CD20+BJAB细胞的生长抑制作用。方法:采用传统分子生物学技术构建p LenR.sc FvCD20:s TRAIL、p LenR.ISZ-s TRAIL、p LenR.sc Fv CD20及p LenR.cop GFP四种慢病毒表达载体,利用四质粒慢病毒包装系统于293T细胞中包装慢病毒颗粒,并感染人脐带组织来源的MSCs(HUMSCs),使其稳定表达融合蛋白。于体外采用CCK8细胞增殖抑制实验检测sc Fv CD20:s TRAIL融合蛋白对CD20阳性BJAB细胞和Raji细胞、CD20阴性Jurkat细胞以及正常人外周血单个核细胞(PBMCs)的生长抑制作用。建立NOD/SCID鼠BJAB细胞皮下移植瘤模型,将MSC.sc Fv CD20:s TRAIL经尾静脉注射入小鼠体内,每3 d测量瘤体积,根据肿瘤体积计算抑瘤率。结果:成功构建了慢病毒表达载体p LenR.sc Fv CD20:s TRAIL、p LenR.ISZ-s TRAIL、p LenR.sc Fv CD20及p LenR.cop GFP,且经慢病毒感染可在HUMSCs中稳定表达。体外实验显示,sc Fv CD20:s TRAIL融合蛋白可不同程度地提高对CD20阳性BJAB和Raji细胞的生长抑制作用,而对CD20阴性Jurkat细胞的生长抑制作用降低;而且不影响PBMCs的生长。体内实验表明,MSC.sc Fv CD20:s TRAIL可显著抑制BJAB淋巴瘤的生长,初始治疗后第24天,抑瘤率达65.2%,与MSC.ISZ:s TRAIL治疗组比较(抑瘤率为52.7%),具统计学差异(P<0.05)。结论:建立了HUMSCs运载sc Fv CD20:s TRAIL融合蛋白的双重靶向治疗系统,HUMSCs可向BJAB淋巴瘤部位归巢并表达分泌sc Fv CD20:s TRAIL融合蛋白,后者在局部经sc Fv CD20的二次导向发挥CD20特异性抑瘤作用。为MSCs作为肿瘤靶向治疗载体在临床中的应用提供了理论依据。 展开更多

关键词 间充质干细胞 CD20 TRAIL 非霍奇金氏淋巴瘤 肿瘤免疫

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低剂量5-Fu与Ad-IL24联用对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及其机制 被引量：2

11

作者 杨圆圆 卢杨 +3 位作者 张晓龙 张晴 李真真 张砚君 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1030-1034,共5页

目的探讨低剂量5-Fu与腺病毒表达的IL24联用对HepG2细胞的生长抑制作用及其机制。方法采用PCR、酶切、连接等方法构建pAd-IL24腺病毒表达载体,Western blot检测IL24蛋白水平表达情况。CCK8法确定5-Fu联用剂量,检测与Ad-IL24联用对HepG2... 目的探讨低剂量5-Fu与腺病毒表达的IL24联用对HepG2细胞的生长抑制作用及其机制。方法采用PCR、酶切、连接等方法构建pAd-IL24腺病毒表达载体,Western blot检测IL24蛋白水平表达情况。CCK8法确定5-Fu联用剂量,检测与Ad-IL24联用对HepG2肝癌细胞的抑制效果,并计算联合指数。流式细胞术检测不同腺病毒感染复数及不同5-Fu浓度下绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性细胞的比例。流式细胞术检测5-Fu作用前后HepG2细胞表面柯萨奇腺病毒受体(coxsackie adenovirus receptor,CAR)的表达变化。结果成功构建腺病毒表达载体pAd-IL24。确定5-Fu联用剂量为1μg/ml和2μg/ml,Ad-IL24与低剂量5-Fu联用可以协同抑制HepG2肝癌细胞生长,联合指数分别为0.75和0.64。低剂量5-Fu作用于HepG2后使其表面CAR水平显著增加(P<0.01)。结论低剂量5-Fu与Ad-IL24联用对HepG2肝癌细胞系的抑制有协同作用,可能与5-Fu上调HepG2表面CAR水平相关。 展开更多

关键词 肝癌 5氟尿嘧啶 IL24 腺病毒 柯萨奇腺病毒受体

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PHⅡ-7通过升高ROS诱导K562和K562/A02凋亡 被引量：4

12

作者 彭洪薇 袁向飞 +3 位作者 李真真 颜次慧 李双静 张砚君 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期911-916,共6页

目的探讨靛玉红衍生物——PHⅡ-7对K562和K562/A02的体外杀伤作用及其机制。方法利用WST-8试剂盒、细胞凋亡检测以及活性氧(ROS)检测研究PHⅡ-7对K562和K562/A02发生杀伤作用的机制。共聚焦显微镜及Western blot分析观察药物处理前后细... 目的探讨靛玉红衍生物——PHⅡ-7对K562和K562/A02的体外杀伤作用及其机制。方法利用WST-8试剂盒、细胞凋亡检测以及活性氧(ROS)检测研究PHⅡ-7对K562和K562/A02发生杀伤作用的机制。共聚焦显微镜及Western blot分析观察药物处理前后细胞的变化。结果细胞毒实验证实PHⅡ-7对K562和K562/A02有相近的杀伤作用。给予上述两种细胞2μmol·L-1PHⅡ-7可见明显的ROS水平升高。PHⅡ-7对K562及K562/A02具有诱导凋亡的作用,呈剂量依赖性。加入ROS的抑制剂NAC可抑制给药后细胞内ROS水平的提高,同时也抑制了PHⅡ-7处理后细胞的凋亡。共聚焦显微镜观察发现药物处理的K562和K562/A02细胞出现明显的凋亡形态改变,Western blot分析表明单用PHⅡ-7可以引起PARP-1及caspase-3,caspase-9的切割,当PHⅡ-7与NAC共同作用之后,上述改变均被抑制。结论 PHⅡ-7可以通过诱导K562/和K562/A02凋亡来实现对上述细胞的杀伤作用,该作用很有可能与其升高细胞内的ROS水平有关。 展开更多

关键词 PHⅡ-7 活性氧 凋亡 NAC P-gp CML

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双病毒共感染的人脐带间充质干细胞多重靶向肝癌细胞的治疗体系的建立 被引量：1

13

作者 杨圆圆 卢杨 +3 位作者 张晓龙 张晴 李真真 张砚君 《生物医学工程与临床》 CAS 2016年第5期450-457,共8页

目的基于间充质干细胞(MSC)向肿瘤部位归巢的能力,利用E1A基因修饰的人脐带间充质干细胞(HUMSC)包装出携带人端粒酶逆转录启动子(hTERTp),以驱动抑癌基因的腺病毒,并感染HepG2肝癌细胞系。方法利用组织块贴壁法从脐带Wharton’s jelly(... 目的基于间充质干细胞(MSC)向肿瘤部位归巢的能力,利用E1A基因修饰的人脐带间充质干细胞(HUMSC)包装出携带人端粒酶逆转录启动子(hTERTp),以驱动抑癌基因的腺病毒,并感染HepG2肝癌细胞系。方法利用组织块贴壁法从脐带Wharton’s jelly(WJ)分离培养HUMSC。以pGL3-basic、pCDH1-MSC1-EF1-Ds Red、pAd-Track等载体为基础,用聚合酶链反应(PCR)、overlap PCR、酶切、连接等技术构建pGL3-hTERTp报告基因载体、pLentiR.E1A慢病毒表达载体、pAd-hTERTp腺病毒表达载体,经测序验证其正确性。利用双荧光素酶的方法鉴定hTERTp的特异性。利用实时定量PCR的方法分别检测MSC.pLentiR+pAd-Track(共转染腺病毒及对照慢病毒的MSC)和MSC.pLentiR.E1A+pAdTrack中不同时间点的病毒相对拷贝数,用电子显微镜观察HUMSC中病毒颗粒的产生。流式细胞术检测由双病毒共感染的HUMSC包装出的腺病毒对HepG2细胞系的感染效率。Transwell方法研究双病毒感染对HUMSC向HepG2细胞趋化的影响。结果成功从脐带WJ组织中分离培养HUMSC。成功构建载体pGL3-hTERTp、pLentiR.E1A、pAd-hTERTp。双荧光素酶方法证明hTERTp在不同肿瘤细胞中具有较高的转录活性,而在正常细胞中转录活性极低。Ad-Track及LentiR.E1A共同感染HUMSC后,随着腺病毒早期复制基因E1A逐渐表达,Ad-Track启动复制程序,最终将MSC裂解并释放具有感染能力的病毒颗粒,进一步感染HepG2细胞。感染双病毒的HUMSC与对照组一致在LentiR.E1A感染后32 h内可以穿过Transwell小室,向培养HepG2细胞的下室迁移。结论经过E1A修饰的HUMSC可包装出携带hTERTp肿瘤特异启动子的复制缺陷型腺病毒,并进一步感染肿瘤细胞的多重靶向治疗系统,为肿瘤的靶向基因治疗提供了新思路。 展开更多

关键词 脐带间充质干细胞 E1A 腺病毒 慢病毒 人端粒酶逆转录启动子(hTERTp) 载体 肿瘤细胞

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IL3融合蛋白稳定性分析、改造及活性研究 被引量：1

14

作者 张砚君 刘荣 +4 位作者 张梦楠 苗庆芳 甄永苏 熊冬生 张益芝 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期117-122,共6页

白细胞介素3受体α链(IL-3Rα链)即CD123抗原在急性髓系白血病(AML)干细胞表面高表达,在正常造血干细胞表面几乎不表达,可用做白血病治疗靶点。本实验室构建融合蛋白IL3-LDM靶向杀伤CD123+的肿瘤干细胞,针对其结构不稳定部位进行质谱鉴... 白细胞介素3受体α链(IL-3Rα链)即CD123抗原在急性髓系白血病(AML)干细胞表面高表达,在正常造血干细胞表面几乎不表达,可用做白血病治疗靶点。本实验室构建融合蛋白IL3-LDM靶向杀伤CD123+的肿瘤干细胞,针对其结构不稳定部位进行质谱鉴定,发现IL3第131位丙氨酸和第132异亮氨对融合蛋白稳定性起关键作用,经分子克隆改造后,IL3融合蛋白的稳定性得以显著提高,蛋白产量、靶向结合能力没有变化,这一发现有望广泛应用于相关蛋白产品中,有效提高IL3融合蛋白类药物的稳定性。 展开更多

关键词 IL3 融合蛋白 基因改造 蛋白质谱 急性髓系白血病

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5-氮杂-2'-脱氧胞苷对多药耐药MCF-7/ADR和KBV/200细胞增殖及细胞周期影响作用机制的研究 被引量：1

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作者 张梦楠 范冬梅 +6 位作者 杨铭 胡蕴慧 李双静 姜琳琳 李真真 张砚君 熊冬生 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期874-879,共6页

目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)对肿瘤多药耐药细胞生长抑制率、细胞周期的影响及可能的作用机制。方法:采用MTT法检测5-Aza-dC对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR、口腔表皮癌多药耐药细胞KBV/200... 目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)对肿瘤多药耐药细胞生长抑制率、细胞周期的影响及可能的作用机制。方法:采用MTT法检测5-Aza-dC对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR、口腔表皮癌多药耐药细胞KBV/200及其相应的亲本敏感MCF-7和KB细胞的生长抑制率;FCM法检测不同浓度5-Aza-dC(1、5和10μmol/L)作用72h及5-Aza-dC(10μmol/L)作用24、48和72h后,各细胞周期分布的变化;分别采用实时荧光定量-PCR及蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin E和p21waf1/cip1mRNA及蛋白的表达情况。结果:5-Aza-dC对耐药细胞株MCF-7/ADR及KBV/200均呈现明显的生长抑制作用,细胞周期被阻滞在G2/M期,并呈时间及剂量依赖性;细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin E和p21waf1/cip1mRNA及蛋白的表达均上调。结论:5-Aza-dC可以通过使MCF-7/ADR及KBV/200细胞的细胞周期被阻滞在G2/M期,从而抑制肿瘤多药耐药细胞的增殖;其作用机制可能与上调细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin E和p21waf1/cip1的表达有关。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤 口腔肿瘤 脱氧胞苷 细胞抑制剂 细胞周期蛋白类

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富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪切因子：预测血液肿瘤耐药的潜在靶点 被引量：1

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作者 任思楣 刘倩 +3 位作者 彭洪薇 张砚君 熊冬生 张益枝 《白血病．淋巴瘤》 CAS 2012年第11期646-649,653,共5页

目的鉴定血液肿瘤细胞耐药相关膜抗原，探讨其在血液肿瘤细胞膜易位表达的普遍性。方法以蛋白电泳和免疫共沉淀法分离并沉淀细胞膜抗原，以质谱分析鉴定抗原信息，通过siRNA基因干扰法和激光共聚焦显微镜法确证抗原信息及其易位细胞膜... 目的鉴定血液肿瘤细胞耐药相关膜抗原，探讨其在血液肿瘤细胞膜易位表达的普遍性。方法以蛋白电泳和免疫共沉淀法分离并沉淀细胞膜抗原，以质谱分析鉴定抗原信息，通过siRNA基因干扰法和激光共聚焦显微镜法确证抗原信息及其易位细胞膜的鉴定结果，通过流式细胞术检测抗原在多种血液肿瘤细胞膜的易位表达。结果免疫共沉淀和质谱等实验证实白血病耐药相关单抗——5D12在HL-60细胞膜抗原为细胞核因子富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪切因子（PSF），经一系列生物学实验确证PSF在HL-60细胞膜的易位表达，在敏感株的膜表达显著高于耐药株的膜表达。流式细胞术检测结果表明PSF的特异性单抗5D12与血液肿瘤多种细胞系的膜结合率为：HL-60（78．56±0．76）％；K562（26．54±4．42）％；Nomalwa（38．10±5．11）％；U937（64．03±7．96）％；Jurkat（29．12±5．58）％；Raji（74．92±3．41）％；CEM（12．18±3．21）％。结论核蛋白PSF易位表达于多种血液肿瘤细胞膜，对维持肿瘤细胞对化疗药的敏感性有重要作用，是血液肿瘤耐药预测的候选靶点。 展开更多

关键词 多药耐药 PSF 血液肿瘤 靶点 检测

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融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3的构建及其靶向性观察 被引量：1

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作者 查剑英 张益枝 +3 位作者 卢杨 杨圆圆 孔凡妮 张砚君 《山东医药》 CAS 北大核心 2017年第23期39-42,共4页

目的构建针对CD19的融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3,并观察其靶向性。方法采用基因克隆技术,构建基因重组质粒p AZY-anti-CD19(Fab)-C_H3,测序鉴定后,转化至大肠杆菌16C9,表达产物经Protein G亲和层析柱纯化后,采用SDS-PAGE电泳Western bl... 目的构建针对CD19的融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3,并观察其靶向性。方法采用基因克隆技术,构建基因重组质粒p AZY-anti-CD19(Fab)-C_H3,测序鉴定后,转化至大肠杆菌16C9,表达产物经Protein G亲和层析柱纯化后,采用SDS-PAGE电泳Western blotting法鉴定纯化蛋白,用高效液相分子排阻色谱法(HPLC-SEC)检测纯化后蛋白中二聚体的比例。采用流式细胞术检测融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3、anti-CD19(Fab)与CD19+的B系淋巴瘤Raji细胞的结合力,采用竞争免疫荧光结合实验检测融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3、anti-CD19(Fab)作用下亲代鼠源性抗体HIT19a和Raji细胞的结合力。结果 SDS-PAGE电泳和Western blotting法均观察到相对分子质量约65 k Da的蛋白条带,与融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3的分子量相符。纯化后蛋白中二聚体比例约为89%。与anti-CD19(Fab)相比,相同浓度的融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3与Raji细胞的结合能力较高。融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3作用下HIT19a-FITC与Raji细胞的结合荧光强度低于等浓度的anti-CD19(Fab)作用下HIT19a-FITC与Raji细胞的结合荧光强度。结论成功构建并表达融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3。与单体antiCD19(Fab)相比,融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3与CD19+的B淋巴瘤细胞Raji的靶向性较好。 展开更多

关键词 anti-CD19(Fab)蛋白 融合蛋白anti-CD19(Fab)-C_H3 B淋巴细胞瘤

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靶向CD123的重组白细胞介素-3-力达霉素融合蛋白对白血病M07e细胞的杀伤机制 被引量：1

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作者 张砚君 李真真 +7 位作者 胡蕴慧 袁向飞 范冬梅 齐怀丰 高雪 孙长海 苗庆芳 甄永苏 《白血病．淋巴瘤》 CAS 2013年第3期136-138,共3页

目的 研究白细胞介素-3-力达霉素（IL-3-LDM）融合蛋白靶向杀伤CD＋123 肿瘤细胞的作用机制。方法 用CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白靶向杀伤人类原巨核细胞白血病MO7e细胞的作用，用IC20浓度的IL-3-LDM及LDM分别与MO7e靶细胞培养后，利用An... 目的 研究白细胞介素-3-力达霉素（IL-3-LDM）融合蛋白靶向杀伤CD＋123 肿瘤细胞的作用机制。方法 用CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白靶向杀伤人类原巨核细胞白血病MO7e细胞的作用，用IC20浓度的IL-3-LDM及LDM分别与MO7e靶细胞培养后，利用AnnexinV-FITC及碘化丙啶（PI）染色经流式细胞分选术检测分析细胞凋亡率和周期分布变化。结果 LDM、IL-3-LDM对MO7e细胞的IC50分别为116、50 pmol／L。经IC20浓度的IL-3-LDM（12 pmol／L）融合蛋白与LDM（30 pmol／L）分别处理MO7e细胞后，在24、48、72 h分别检测到细胞凋亡率呈逐渐上升趋势（IL-3-LDM组分别为26.1 %、59.3 %和62.1 %，LDM组分别为34.4 %、43.3 %和55.2 %），且细胞在处理48和72 h后出现明显的G2／M期阻滞现象，与没有靶向的LDM药物作用机制一致。结论 IL-3-LDM融合蛋白作用机制与LDM一致，通过引起细胞G2／M期阻滞导致细胞凋亡进而死亡，证明IL-3靶向作用及其携带的高效药物LDM杀伤作用的有效性。 展开更多

关键词 重组融合蛋白质类 力达霉素 白细胞介素-3 白血病 细胞周期 细胞凋亡

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耐力运动能力与合理脂肪摄入关联分析 被引量：1

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作者 张阜新 张砚君 《南京体育学院学报（自然科学版）》 2004年第3期9-12,共4页

将新近有关脂肪摄取与有氧运动能力的研究进行综述。综合以往的试验结果,在训练或比赛期间,饮食的合理组成应该是30%的碳水化合物,30%的脂肪和20%的蛋白质。

关键词 耐力 脂肪 运动

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钙调素拮抗剂O-(4-乙氧基)-丁基-小檗胺增强阿霉素杀伤MCF-7/ADR细胞的机制研究 被引量：1

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作者 赵英新 刘荣 +5 位作者 范冬梅 任思楣 李崴 师锐赞 张砚君 杨铭 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期231-235,共5页

目的研究钙调素拮抗剂0-4-乙氧基-丁基-小檗胺(EBB)增强阿霉素诱导乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR细胞的杀伤作用及其相关机制。方法用MTT法测定阿霉素、EBB单独及联合用药对阿霉素杀伤乳腺癌多药耐药细胞系(MCF-7/ADR)及其亲代细胞系(M... 目的研究钙调素拮抗剂0-4-乙氧基-丁基-小檗胺(EBB)增强阿霉素诱导乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR细胞的杀伤作用及其相关机制。方法用MTT法测定阿霉素、EBB单独及联合用药对阿霉素杀伤乳腺癌多药耐药细胞系(MCF-7/ADR)及其亲代细胞系(MCF-7)的作用的IC50值,用不同浓度EBB处理MCF-7/ADR细胞后用FACS法分析EBB对阿霉素诱导细胞凋亡及对mdr1mRNA和P-gp蛋白水平表达的影响,通过激光共聚焦显微镜观察EBB处理前后及用EBB预处理24和48h后MCF-7/ADR和MCF-7细胞内阿霉素浓度的改变。结果MTT结果显示EBB对MCF-7和MCF-7/ADR都具有抗肿瘤活性;EBB还能协同提高阿霉素的细胞毒作用,MCF-7组两药相互作用指数(CDI)值为0.73,MCF-7/ADR组CDI值为0.49,其对耐药细胞的协同作用更为明显。随EBB剂量增加,低剂量阿霉素诱导MCF-7/ADR细胞凋亡增加而且P-gp蛋白表达水平逐渐下降,细胞内阿霉素浓度逐渐提高,而且用EBB预处理MCF-7/ADR细胞24和48h后细胞内阿霉素和罗丹明浓度也逐渐提高。结论EBB是有效的肿瘤细胞化疗药物,它不但能直接抑制P-gp功能还具有下调P-gp蛋白表达的作用,从而有效逆转MCF-7/ADR细胞的耐药现象,协同增强化疗药物对耐药细胞的杀伤作用。 展开更多

关键词 多药耐药 EBB MDR1基因 P-GP 阿霉素 共聚焦激光扫描显微镜 MCF-7/ADR细胞系

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