目的 融合表达源自细胞表面蛋白tetrabrachion的四聚化卷曲螺旋结构域(tetrameric coiled-coil domain of the cell-surface protein tetrabrachion,TdoT)的蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SI),并研究其重组酶的酶学性质。方法 分别将Tdo...目的 融合表达源自细胞表面蛋白tetrabrachion的四聚化卷曲螺旋结构域(tetrameric coiled-coil domain of the cell-surface protein tetrabrachion,TdoT)的蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SI),并研究其重组酶的酶学性质。方法 分别将TdoT与SI的N/C-端融合,构建重组表达载体pET-24a-TdoT-SI和pET-24b-SI-TdoT,转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,纯化重组酶后进行酶学性质表征和产物特异性研究。结果 TdoT-SI和SI-TdoT表达为具有催化活性的包涵体,而未融合TdoT的SI包涵体则无催化活性。酶学性质表征结果显示,TdoT-SI和SI-TdoT活性包涵体的最适反应温度均为40℃,最适反应pH分别为5.5和5.0。TdoT-SI活性包涵体的动力学常数K_(m)为(103.9±9.5)mmol/L,k_(cat)/K_(m)为(0.06±0.002)L/(mmol·s);SI-TdoT活性包涵体的动力学常数K_(m)为(54.4±6.6)mmol/L,k_(cat)/K_(m)为(0.03±0.002)L/(mmol·s)。产物特异性分析结果显示,随着反应温度升高,产物中异麦芽酮糖含量并未出现较大变化,而产物中海藻酮糖含量随转化反应温度升高而降低,同时单糖的含量随转化反应温度升高而增加。结论 通过融合表达技术成功制备出融合卷曲螺旋结构域的SI活性包涵体,其作为一种新型自固定化酶,具有同步实现表达和固定化的优势,为实现重组SI的规模化制备和高效利用提供了新策略。展开更多
文摘目的 融合表达源自细胞表面蛋白tetrabrachion的四聚化卷曲螺旋结构域(tetrameric coiled-coil domain of the cell-surface protein tetrabrachion,TdoT)的蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SI),并研究其重组酶的酶学性质。方法 分别将TdoT与SI的N/C-端融合,构建重组表达载体pET-24a-TdoT-SI和pET-24b-SI-TdoT,转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,纯化重组酶后进行酶学性质表征和产物特异性研究。结果 TdoT-SI和SI-TdoT表达为具有催化活性的包涵体,而未融合TdoT的SI包涵体则无催化活性。酶学性质表征结果显示,TdoT-SI和SI-TdoT活性包涵体的最适反应温度均为40℃,最适反应pH分别为5.5和5.0。TdoT-SI活性包涵体的动力学常数K_(m)为(103.9±9.5)mmol/L,k_(cat)/K_(m)为(0.06±0.002)L/(mmol·s);SI-TdoT活性包涵体的动力学常数K_(m)为(54.4±6.6)mmol/L,k_(cat)/K_(m)为(0.03±0.002)L/(mmol·s)。产物特异性分析结果显示,随着反应温度升高,产物中异麦芽酮糖含量并未出现较大变化,而产物中海藻酮糖含量随转化反应温度升高而降低,同时单糖的含量随转化反应温度升高而增加。结论 通过融合表达技术成功制备出融合卷曲螺旋结构域的SI活性包涵体,其作为一种新型自固定化酶,具有同步实现表达和固定化的优势,为实现重组SI的规模化制备和高效利用提供了新策略。
