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稳定表达大电导钙激活钾通道α亚基的细胞株构建及其排钾的分子机制研究
1
作者 应思琦 张娅 +3 位作者 郭琴 杨阳 刘爽 张翀 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1142-1147,共6页
目的·构建稳定表达大电导钙激活钾通道(large conductance Ca^2+-activated K+channel, MaxiK或BK)α亚基的HEK293细胞株,探讨BKα通道的排钾机制。方法·构建带Myc标签的BKα质粒,采用脂质体转染方法将BKα质粒转染至HEK293... 目的·构建稳定表达大电导钙激活钾通道(large conductance Ca^2+-activated K+channel, MaxiK或BK)α亚基的HEK293细胞株,探讨BKα通道的排钾机制。方法·构建带Myc标签的BKα质粒,采用脂质体转染方法将BKα质粒转染至HEK293细胞系中,用药物G418筛选阳性单克隆细胞株,分别以Western blotting和细胞免疫荧光法检测BKα蛋白表达及定位。将稳定表达BKα蛋白的HEK293细胞系培养于玻片,形成单细胞层,分别给予5 mmol/L和100 mmol/L钾离子浓度的浴液,膜片钳单通道记录BKα的离子流。内向整流性钾通道Kir4.1的野生型和突变型(G77R、G130R、C140R和R297C)分别转染稳定转染BKα的HEK293细胞后提取膜蛋白,Western blotting检测BKα的表达情况。结果·转染后的HEK293细胞中挑选表达BKα通道的细胞株,细胞免疫荧光验证了BKα通道表达及其在细胞膜上表达。在给予100 mmol/L钾离子浓度浴液的情况下,BKα的通道开放频率(NPo)快速增加。Kir4.1的野生型和突变型分别转染稳定转染BKα的HEK293细胞后提取膜蛋白,Western blotting检测发现转染Kir4.1突变体质粒的HEK293细胞的BKα表达较野生型增加(P<0.05)。结论·成功地建立了稳定表达BKα的HEK293细胞株,BKα通道可以被高钾溶液激活;BKα通道的膜表达水平与Kir4.1通道功能状态有关,可能是由于突变的Kir4.1通道导致细胞去极化,从而激活BKα。 展开更多
关键词 大电导钙激活钾通道 内向整流通道Kir4.1 肾小管 钾离子排泄
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NKCC1在慢性肾脏病大鼠主动脉纤维化中的作用研究
2
作者 刘爽 刘怡晟 +2 位作者 应思琦 潘林蓉 蒋更如 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2020年第5期763-771,共9页
该文探讨了Na-K-2Cl协同转运蛋白1(Na-K-2Cl cotransporter 1,NKCC1)在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)大鼠主动脉纤维化中的作用。采用5/6肾切除方法建立CKD大鼠模型,尾套法测定大鼠血压,脲酶法测定血清尿素氮(blood urea nitr... 该文探讨了Na-K-2Cl协同转运蛋白1(Na-K-2Cl cotransporter 1,NKCC1)在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)大鼠主动脉纤维化中的作用。采用5/6肾切除方法建立CKD大鼠模型,尾套法测定大鼠血压,脲酶法测定血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),肌氨酸氧化酶法测定血清肌酐(serum creatinine,Scr);利用苏木素–伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察组织形态,Masson染色观察组织纤维化情况;利用Real-time PCR、Western blot和免疫组织化学染色法检测大鼠肾脏和主动脉组织中NKCC1的表达;体外培养大鼠主动脉内皮细胞(endothelial cell,EC),通过免疫荧光实验观察细胞中Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ,Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Collagen-Ⅲ,Col-Ⅲ)的表达,利用Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、血小板–内皮细胞黏附分子(CD31)、钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的表达。结果显示,CKD大鼠的平均收缩压(systolic blood pressure,SBP)较术前和假手术组(sham)均明显升高(P<0.05),BUN和Scr显著高于sham组(P<0.05);CKD大鼠肾脏和主动脉组织损伤严重且纤维化明显,NKCC1的表达较sham组明显增加;醛固酮(aldosterone)使EC中NKCC1、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ增多,间质细胞标志物α-SMA和vimentin上调,内皮细胞标志物CD31和E-cadherin下调,在此基础上用布美他尼(bumetanide)使NKCC1、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ减少,α-SMA和vimentin表达下降,CD31和E-cadherin升高。该研究表明,NKCC1可能通过增强内皮–间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndoMT)促进CKD主动脉纤维化。 展开更多
关键词 Na-K-2Cl协同转运蛋白1 慢性肾脏病 纤维化 主动脉 内皮–间质转化
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