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CRISPR/Cas系统中工程化gRNA技术的研究和应用
1
作者 谈鎏 叶邦策 尹斌成 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1078-1092,共15页
CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具。其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现... CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具。其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达。作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域。随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力。基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas系统 gRNA工程化 基因编辑 特异性
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非修饰性寡核苷酸芯片用于HLA-DQA分型的初步研究
2
作者 尹斌成 叶邦策 曹学君 《华东理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2007年第1期37-41,共5页
利用非修饰寡核苷酸基因芯片技术,根据HLAⅡ类抗原DQA位点不同基因亚型的特异性序列设计探针,制成分型芯片;待测样本经PCR反应标记上荧光之后,与探针在芯片上进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值,确定样品DQA位点基因亚型。将这一方法应... 利用非修饰寡核苷酸基因芯片技术,根据HLAⅡ类抗原DQA位点不同基因亚型的特异性序列设计探针,制成分型芯片;待测样本经PCR反应标记上荧光之后,与探针在芯片上进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值,确定样品DQA位点基因亚型。将这一方法应用于125例临床样本和10例标准品的HLA-DQA分型,该方法分型的结果与准确结果相比,准确率达到93.3%。实验结果表明:非修饰性寡核苷酸芯片用于HLA-DQA分型技术可行。 展开更多
关键词 非修饰寡核苷酸芯片 HLA—DQA 基因分型
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基于纳米金与纳米银簇间表面等离子增强能量转移效应特异性检测microRNA 被引量：1
3
作者 王红亚 尹斌成 叶邦策 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2017年第12期2018-2025,共8页
microRNAs(miRNAs)的灵敏检测对临床诊断具有十分重要的意义。本研究采用偶联DNA聚合酶和核酸内切酶介导的恒温扩增反应实现靶标循环再生的策略,利用纳米金(Au NPs)与纳米银簇(Ag NCs)间表面等离子增强能量转移效应,开发了一种miRNA定... microRNAs(miRNAs)的灵敏检测对临床诊断具有十分重要的意义。本研究采用偶联DNA聚合酶和核酸内切酶介导的恒温扩增反应实现靶标循环再生的策略,利用纳米金(Au NPs)与纳米银簇(Ag NCs)间表面等离子增强能量转移效应,开发了一种miRNA定量检测方法。在AuNPs表面组装两种探针(Probe a和Probe b)制备响应元件Probe b-Probe a-Au NP,其中Probe a通过3'端巯基共价偶联到Au NPs表面,此外具有靶标miRNA互补序列、核酸内切酶酶切序列和Probe b互补序列,Probe b为荧光Ag NCs合成模板。靶标miRNA存在时,启动酶级联恒温扩增反应,导致Probe b脱离Au NPs表面,抑制了Probe b为模板合成的Ag NCs与Au NPs间表面等离子增强能量转移效应,使得反应体系荧光信号增强。本方法的检出限为2.5×10^(-1)1mol/L,与miRNAs商业化检测试剂盒相比,避免了逆转录反应,而且操作简单,检测成本低,可应用于生物样本中miRNAs分析。 展开更多
关键词 microRNA检测 纳米金 纳米银簇 表面等离子增强能量转移效应
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基于核酸序列依赖性扩增反应比色法检测沙门氏菌 被引量：1
4
作者 史杨 尹斌成 叶邦策 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2016年第5期-,共6页
本文以食源性致病菌中危害居于前列的沙门氏菌侵袭蛋白A基因作为检测靶标,通过改进传统的核酸序列依赖性扩增反应,开发了针对长链DNA的纳米金比色检测方法。本方法利用限制性内切酶和连接酶将T7启动子和终止子序列连接至靶标序列上,形... 本文以食源性致病菌中危害居于前列的沙门氏菌侵袭蛋白A基因作为检测靶标,通过改进传统的核酸序列依赖性扩增反应,开发了针对长链DNA的纳米金比色检测方法。本方法利用限制性内切酶和连接酶将T7启动子和终止子序列连接至靶标序列上,形成小型环状双链DNA,在T7 RNA聚合酶的作用下,转录出大量单链RNA序列进行NASBA反应,反应终产物能够促发纳米金探针发生交联聚集,溶液颜色从红色变成蓝色,从而实现对沙门氏菌的定量分析。 展开更多
关键词 沙门氏菌 invA基因 核酸序列依赖性扩增 纳米金 比色反应
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无胶筛分毛细管电泳对SNP分型的初步研究 被引量：1
5
作者 王先飞 尹斌成 叶邦策 《化学与生物工程》 CAS 2008年第12期42-47,共6页
建立了非涂层无胶筛分毛细管电泳对多个SNP位点快速分型的方法。采用长度为20 bp和40 bp的DNA片段为实验对象,对筛分介质的种类及其质量浓度、电泳缓冲溶液的浓度及其pH值、分离电压进行了优化,确定最合适的分离条件如下:6%PDMA为筛分介... 建立了非涂层无胶筛分毛细管电泳对多个SNP位点快速分型的方法。采用长度为20 bp和40 bp的DNA片段为实验对象,对筛分介质的种类及其质量浓度、电泳缓冲溶液的浓度及其pH值、分离电压进行了优化,确定最合适的分离条件如下:6%PDMA为筛分介质,缓冲溶液TAPS浓度为100 mmol.L-1、pH值为8,分离电压为15 kV。并在此条件下成功地对3个SNP位点进行分型。结果表明,以PDMA为筛分介质的非涂层无胶筛分毛细管电泳方法用于SNP分型是可行的,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简单快速、结果直观等优点。 展开更多
关键词 无胶筛分 毛细管电泳 SNP分型
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电化学DNA传感器方法检测微量博来霉素
6
作者 吴迪 尹斌成 叶邦策 《现代农业科技》 2011年第15期17-18,共2页
博来霉素广泛用于多种癌症的治疗中,但其在临床使用中存在一些毒副作用。通过设计一个电化学DNA传感器来简单、快速地检测微量博来霉素,试验结果表明该传感器检测博来霉素的最低检测限达到0.3 ng/mL,并且证明这个传感器在血清中也有良... 博来霉素广泛用于多种癌症的治疗中,但其在临床使用中存在一些毒副作用。通过设计一个电化学DNA传感器来简单、快速地检测微量博来霉素,试验结果表明该传感器检测博来霉素的最低检测限达到0.3 ng/mL,并且证明这个传感器在血清中也有良好的稳定性,在30 min就可以完成整个检测过程。 展开更多
关键词 电化学 DNA传感器 博来霉素 检测
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工程化外泌体介导巨噬细胞清除肿瘤外泌体 被引量：3
7
作者 王璐 陈梦丽 +3 位作者 何芳 项建 尹斌成 叶邦策 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1-11,共11页
目的:通过膜表面修饰改造技术构建工程化外泌体(engineered exosomes,enExos),并以此介导巨噬细胞特异性清除膜表面富含表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的肿瘤外泌体。方法:利用表面展示技术获得膜表面展示趋... 目的:通过膜表面修饰改造技术构建工程化外泌体(engineered exosomes,enExos),并以此介导巨噬细胞特异性清除膜表面富含表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的肿瘤外泌体。方法:利用表面展示技术获得膜表面展示趋化因子(chemokine 8,CXCL8)的外泌体,同时在其磷脂双分子层上修饰EGFR核酸适配体制备工程化外泌体;纳米颗粒跟踪和纳米粒度电位分析enExos的尺寸、电位;CCK-8试剂盒检测细胞活力;透射电子显微镜观察enExos与高表达EGFR的肿瘤外泌体的特异性结合;荧光成像技术及流式细胞术分析探究enExos靶向趋化巨噬细胞吞噬高表达EGFR的肿瘤外泌体。结果:成功构建膜表面展示EGFR与CXCL8的工程化外泌体,enExos可以特异性识别并捕获高表达EGFR的肿瘤外泌体,同时利用其趋化因子CXCL8特异性靶向巨噬细胞膜表面趋化因子受体CXCR1/CXCR2,刺激巨噬细胞对肿瘤外泌体的捕获及清除。结论:工程化外泌体促进了特定肿瘤外泌体的清除,为后续深入研究工程化外泌体抑制癌症转移的作用奠定基础,并期望为癌症转移治疗提供新的研究方向。 展开更多
关键词 工程化外泌体 肿瘤外泌体 表皮生长因子受体 白细胞介素-8 吞噬
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功能化外泌体重编程免疫细胞与肿瘤细胞之间靶向识别
8
作者 项建 叶邦策 尹斌成 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1-9,共9页
目的:通过基因工程技术制备表面展示具有促进膜融合作用的水泡性口炎病毒糖蛋白G(vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSVG)的外泌体VSVG-Exos,利用核酸探针介导DNA杂交链式反应在其膜表面修饰靶向树突状细胞间黏附分子-3-结合非... 目的:通过基因工程技术制备表面展示具有促进膜融合作用的水泡性口炎病毒糖蛋白G(vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSVG)的外泌体VSVG-Exos,利用核酸探针介导DNA杂交链式反应在其膜表面修饰靶向树突状细胞间黏附分子-3-结合非整合素DC-SIGN的核酸适配体,构建功能化外泌体,通过重编程肿瘤细胞与树突细胞之间的靶向识别过程增强相互作用。方法:以小鼠乳腺癌细胞4T1和小鼠树突状细胞DC2.4为研究对象,通过共聚焦成像和流式细胞术等实验证明VSVG-Exos以膜融合方式特异性结合4T1细胞,以及DC-SIGN适配体具有特异性靶向DC2.4细胞的能力。结果:功能化外泌体可以重编程修饰4T1细胞,增强与DC2.4细胞之间的靶向识别效应。结论:功能化外泌体有效地输送具有特定功能的分子到肿瘤细胞表面,对其进行重编程修饰,提高免疫细胞精准定位和高效攻击肿瘤细胞的能力,为靶向清除肿瘤细胞提供了新的思路和策略。 展开更多
关键词 功能化外泌体 靶向识别 核酸适配体 膜融合 水泡性口炎病毒糖蛋白
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细胞膜锚定DNA四面体传感器实时监测外泌体的分泌 被引量：3
9
作者 赵丽东 左鹏 +2 位作者 尹斌成 洪成林 叶邦策 《化学学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2020年第10期1076-1081,共6页
外泌体是细胞主动分泌的一种纳米级双层膜结构的小囊泡,能够直接反映分泌细胞的生理和功能状态,进行细胞间的物质运输和信息通讯,并参与多种生理及病理过程.本文针对细胞分泌外泌体的动态过程,以DNA四面体为基础,结合细胞膜修饰技术和... 外泌体是细胞主动分泌的一种纳米级双层膜结构的小囊泡,能够直接反映分泌细胞的生理和功能状态,进行细胞间的物质运输和信息通讯,并参与多种生理及病理过程.本文针对细胞分泌外泌体的动态过程,以DNA四面体为基础,结合细胞膜修饰技术和荧光成像技术,构建了一种易操作、高稳定性的细胞膜表面DNA四面体传感器,应用于不同细胞类型分泌外泌体的实时监测. DNA四面体传感器通过脚支链与疏水性胆固醇探针的杂交互补作用锚定于细胞膜表面,利用四跨膜蛋白CD63核酸适配体序列特异性捕获细胞膜表面释放的外泌体,通过监测细胞膜表面荧光的变化,实时测定外泌体的分泌情况. 展开更多
关键词 细胞膜表面传感器 DNA四面体 外泌体 分泌 实时监测 核酸适配体
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