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根癌农杆菌化学受体MCP_(1912)调节趋化响应功能的鉴定
1
作者 宗仁杰 高苗苗 +3 位作者 张梦琪 王浩 徐楠 郭敏亮 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1949-1961,共13页
【目的】本研究以根癌农杆菌C58为材料,鉴定其甲基趋化受体蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein,MCP)MCP_(1912)能够识别的配体,并研究该蛋白在调控根癌农杆菌趋化响应中的具体功能。【方法】通过异源表达MCP_(1912)的配体结合结... 【目的】本研究以根癌农杆菌C58为材料,鉴定其甲基趋化受体蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein,MCP)MCP_(1912)能够识别的配体,并研究该蛋白在调控根癌农杆菌趋化响应中的具体功能。【方法】通过异源表达MCP_(1912)的配体结合结构域(ligand binding domain,LBD),获得带有His标签的LBD蛋白(LBD_(1912))。利用基于荧光的热位移测定法(fluorescence-based thermal shift assay,TSA)筛选出LBD_(1912)的潜在配体;通过等温滴定量热(isothermal titration calorimetry,ITC),进一步确定筛选出的潜在配体,并测定LBD_(1912)与配体结合之后的解离平衡常数K_(D)。利用基于同源重组的精准DNA片段删除方法,敲除根癌农杆菌C58中编码MCP_(1912)的基因atu1912,获得MCP_(1912)缺失突变体(ΔMCP_(1912));以质粒回补的方法,获得ΔMCP_(1912)回补株(ΔMCP_(1912)C)。利用毛细管趋化测定法,测定根癌农杆菌及其突变体对筛选出来的MCP_(1912)潜在配体的趋化响应,并最终确定MCP_(1912)在调控根癌农杆菌C58趋化响应中的具体功能。【结果】通过TSA,筛选出5种能引起LBD_(1912)的熔解温度(Tm)变化大于2℃的潜在配体(大于2℃意味着可能结合),这5种潜在配体是丙酮酸、L-乳酸、丙酸、乙酸和乙醇酸。ITC实验进一步确定,只有丙酮酸和丙酸能与LBD_(1912)特异性结合。丙酮酸与LBD_(1912)的结合是放热过程,KD为(17.0±0.9)μmol/L,而丙酸与LBD_(1912)的结合是吸热过程,K_(D)为(31.5±5.4)μmol/L。毛细管趋化试验证实,根癌农杆菌C58能够被丙酮酸吸引和躲避丙酸,MCP_(1912)的缺失,完全消除了根癌农杆菌对这两种物质的趋化响应,MCP_(1912)的回补能够恢复其对这两种物质的趋化响应。【结论】化学受体MCP_(1912)识别的配体是丙酸和丙酮酸,MCP_(1912)介导C58对于丙酮酸的吸引趋化响应以及躲避丙酸的趋化响应。 展开更多
关键词 根癌农杆菌 甲基趋化受体蛋白 趋化响应 吸引物 驱避剂 配体结合结构域
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根癌农杆菌vbp2基因启动子转录调控的探析 被引量：1
2
作者 徐楠 徐宇娟 +2 位作者 孙盼 宗仁杰 郭敏亮 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期41-49,共9页
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)能够将自身质粒上的部分DNA片段(简称T-DNA)以T-复合物的形式转运、整合至宿主基因组,而用作高效的植物转基因工具。vbp2是编码VBP蛋白的3个同源基因之一,VBP蛋白通过与T-复合物上的VirD2结合参与... 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)能够将自身质粒上的部分DNA片段(简称T-DNA)以T-复合物的形式转运、整合至宿主基因组,而用作高效的植物转基因工具。vbp2是编码VBP蛋白的3个同源基因之一,VBP蛋白通过与T-复合物上的VirD2结合参与T-DNA的转运过程。根据生物信息学预测,vbp2基因的启动子区可能含有多个转录调控元件。通过同源重组的方法,将A.tumefaciens染色体上的vbp2基因替换成编码红色荧光蛋白的rfp基因,使vbp2的启动子控制rfp的表达,因此,可通过测定所表达的RFP的荧光强度来表征vbp2启动子的活性。结果表明:乙酰丁香酮(AS)和鼠李糖(Rha)均能诱导vbp2启动子表达RFP,AS和Rha的最佳诱导浓度分别为150μmol/L和100μmol/L。通过截短vbp2启动子DNA片段的方法,证明响应AS和Rha诱导的调控区域分别位于上游的165-260 bp和126-165 bp。 展开更多
关键词 根癌农杆菌 vbp2基因 转录调控 转录活性 荧光蛋白
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