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小分子药物索非布韦对牛病毒性腹泻病毒体外复制的影响 被引量：1
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作者 付强 贺渊秀 +5 位作者 李泽宇 塞力克·杰恩斯 周渝新 杨莉 冉多良 史慧君 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第7期2653-2660,共8页
试验旨在研究小分子药物索非布韦是否具有抑制牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用。通过MTT法测定了不同时间和不同浓度索非布韦对牛肾细胞(MDBK)增殖的影响;采用免疫荧光染色试验筛选出能有效抑制BVDV复制... 试验旨在研究小分子药物索非布韦是否具有抑制牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用。通过MTT法测定了不同时间和不同浓度索非布韦对牛肾细胞(MDBK)增殖的影响;采用免疫荧光染色试验筛选出能有效抑制BVDV复制的索非布韦最适浓度,用实时荧光定量PCR、致细胞病变作用(CPE)和病毒半数组织细胞感染量(TCID50)测定的方法检测索非布韦对BVDV复制的影响。结果显示,索非布韦处理MDBK细胞24和48 h能极显著抑制细胞增殖(P<0.01);与对照组相比,当索非布韦浓度为800μmol/L时免疫荧光染色检测BVDV感染MDBK细胞的双链RNA(dsRNA)含量极显著降低(P<0.01);实时荧光定量PCR检测发现,与DMSO处理组相比,BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞,BVDV 5′UTR mRNA含量在病毒感染24和48 h时极显著降低(P<0.01);BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞病变现象明显减弱;索非布韦处理24 h后能极显著减弱BVDV感染MDBK细胞后子代病毒颗粒的形成组与释放(P<0.01),降低病毒滴度。综合上述结果表明,小分子药物索非布韦能有效抑制BVDV体外复制。 展开更多
关键词 索非布韦 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 抗病毒药物
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牛ATG10基因的克隆、原核表达、纯化和生物信息学分析
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作者 贺渊秀 付强 +3 位作者 塞力克·杰恩斯 李丹 葛丽娟 史慧君 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2023年第11期15-20,137,共7页
为了获得牛自噬相关基因10(ATG10)蛋白,试验参照GenBank中牛ATG10基因设计引物,PCR扩增ATG10基因,与pET-N-His-TEV载体连接,测序鉴定正确后用IPTG诱导ATG10蛋白表达,利用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化,Western-blot鉴定ATG10蛋白表达情... 为了获得牛自噬相关基因10(ATG10)蛋白,试验参照GenBank中牛ATG10基因设计引物,PCR扩增ATG10基因,与pET-N-His-TEV载体连接,测序鉴定正确后用IPTG诱导ATG10蛋白表达,利用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化,Western-blot鉴定ATG10蛋白表达情况,通过生物信息学在线软件对ATG10蛋白进行分析,获得其相应的理化性质及参数。结果表明:克隆得到的ATG10基因序列长度约为705 bp,测序鉴定正确后得到pET-N-His-TEV-ATG10原核表达载体,IPTG成功诱导表达了ATG10蛋白,分子量为28 ku;ATG10蛋白与兔抗ATG10抗体特异性结合;ATG10蛋白是一种较为稳定的、含38个潜在的磷酸化位点、无跨膜区及信号肽的亲水性蛋白,二级结构中无规则卷曲占比44.44%,与ATG5、ATG12、ATG16L1、ATG3等多个自噬相关蛋白相互作用。说明试验成功构建出pET-N-His-TEV-ATG10原核表达载体,并获得ATG10蛋白。 展开更多
关键词 自噬相关基因10(ATG10) 基因克隆 原核表达 纯化 生物信息学分析
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小檗胺影响牛病毒性腹泻病毒体外复制的研究
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作者 付强 李泽宇 +8 位作者 贺渊秀 塞力克·杰恩斯 李丹 葛丽娟 李金月 谭美玲 杨莉 岳剑波 史慧君 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第4期33-40,共8页
本研究旨在研究天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛病毒性腹泻病毒(BVDV)体外复制。分别配制0、1、5、8、10、15、20μmol/L浓度的BBM,使用MTT法检测BBM对MDBK细胞增殖的影响;并选择抑制作用相对较小浓度的BBM处理牛肾细胞(MDBK)8 h... 本研究旨在研究天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛病毒性腹泻病毒(BVDV)体外复制。分别配制0、1、5、8、10、15、20μmol/L浓度的BBM,使用MTT法检测BBM对MDBK细胞增殖的影响;并选择抑制作用相对较小浓度的BBM处理牛肾细胞(MDBK)8 h后感染BVDV,使用免疫荧光技术检测BVDV双链RNA(ds RNA)含量,确定最佳用药浓度;分别使用实时荧光定量PCR、Reed-Muench法、倒置显微镜观察来检测BBM对BVDV RNA复制、病毒滴度变化、致细胞病变效应(CPE)的影响。结果显示:10μmol/L BBM对BVDV dsRNA积累具有显著性抑制作用,同时该浓度对MDBK细胞的毒性作用较小;同时采取荧光定量PCR检测和滴度测定,发现在72 h内BVDV感染BBM处理的MDBK细胞与对照相比,5’UTR mRNA水平和子代病毒滴度显著性降低,在BVDV感染24 h和36 h时,子代病毒滴度差异性最大;BVDV感染对照组处理的MBDK细胞会造成严重的CPE现象,而BVDV感染BBM处理的细胞CPE现象较弱。以上结果表明,本研究初步验证BBM显著抑制BVDV在细胞中的复制。 展开更多
关键词 小檗胺 牛病毒性腹泻病毒 病毒复制 双链RNA
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猪流行性腹泻病毒N基因克隆及实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 李丹 付强 +3 位作者 塞力克·杰恩斯 王万顺 刘芯怡 史慧君 《新疆农业大学学报》 CAS 2021年第5期361-366,共6页
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起5~8周龄断奶仔猪出现顽固性腹泻,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究基于PEDV核衣壳蛋白(N,nucleocapsid)基因建立实时荧光定量PCR检测方法,将为PEDV诊断提供重要的方... 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起5~8周龄断奶仔猪出现顽固性腹泻,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究基于PEDV核衣壳蛋白(N,nucleocapsid)基因建立实时荧光定量PCR检测方法,将为PEDV诊断提供重要的方法。采集猪流行性腹泻新鲜粪便样品,提取总RNA后反转录成cDNA,使用PCR扩增PEDV N基因,并克隆至pMD19-T载体,经测序后获得N基因序列,提交NCBI Blast完成基因序列分析和遗传进化树构建;设计实时荧光定量PCR引物,以pMD19-T-N质粒为模板,将其稀释成不同浓度,使用SYBR Green I实时荧光定量PCR测定Ct值,并建立标准曲线,分析其线性回归系数和扩增效率,确定最低检测下限。研究结果表明,成功克隆PEDV N基因,大小为750 bp,并成功构建pMD19-T-N载体,经测序后分析发现PEDV N基因与GenBank数据库中多个PEDV毒株同源性高达98%以上,其中与KU847996.1亲缘关系最近,高达98.93%,属于同一个遗传进化分支;基于N基因建立SYBR Green I实时荧光定量PCR,线性回归系数和扩增效率分别为0.994和97.57%,最低检测下限为10 copies/μL。综上表明成功克隆PEDV N基因,并基于N基因成功建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测PEDV方法,为今后PEDV的有效防控提供参考。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 N基因 遗传进化树 实时荧光定量PCR
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小檗胺对牛病毒性腹泻病毒感染BALB/c小鼠的影响研究
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作者 付强 李泽宇 +4 位作者 贺渊秀 塞力克·杰恩斯 杨莉 岳剑波 史慧君 《畜牧与兽医》 北大核心 2021年第11期97-104,共8页
试验旨在研究天然小分子化合物小檗胺(berbamine, BBM)对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染BALB/c小鼠的影响。共分为预防保护和治疗两部分试验。预防保护试验将24只BALB/c小鼠随机分成3组,每组8只,使用0、50、1... 试验旨在研究天然小分子化合物小檗胺(berbamine, BBM)对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染BALB/c小鼠的影响。共分为预防保护和治疗两部分试验。预防保护试验将24只BALB/c小鼠随机分成3组,每组8只,使用0、50、100 mg/kg BBM提前灌胃,每24 h灌胃1次,连续灌胃3 d,滴鼻感染BVDV 48 h后再次感染,于感染后继续每24 h灌胃,感染后5和10 d时分别处死4只,取肝、脾、肾、小肠等组织使用荧光定量PCR(qPCR)检测BVDV 5′UTR水平;制备病理切片并使用H&E染色检测各组织病变情况。治疗试验中将24只BALB/c小鼠随机分成2组,BVDV滴鼻感染,48 h后再次感染后使用0和100 mg/kg BBM灌胃BALB/c小鼠,每24 h灌胃1次,于感染后3、6和10 d时分别处死4只小鼠,使用qPCR检测BVDV载量,通过病理切片检测各组织病变情况。结果显示,预防保护试验发现,与对照组相比,50和100 mg/kg BBM使BVDV感染后各组织5′UTR水平最大降低约72倍,处理剂量与抑制作用呈正相关;病理切片观察发现,与对照组相比,50和100 mg/kg BBM可减少BVDV感染引起的肝、脾、肾、肠等组织病变,且其作用与剂量呈正相关。治疗试验发现,100 mg/kg BBM处理不同时间均能显著性抑制BVDV 5′UTR水平,最大降低约26倍;病理切片观察发现,与对照组相比100 mg/kg BBM在不同时间均能缓解BVDV感染引起的肝、脾、肾、肠等组织充血水肿,且其作用与剂量呈正相关。研究表明,BBM进行预防保护试验和治疗试验均能显著性抑制BVDV体内复制,减轻BVDV感染造成的组织器官病理变化,表明BBM具有较好的抗BVDV感染BALB/c小鼠的作用。 展开更多
关键词 小檗胺 牛病毒性腹泻病毒 预防保护试验 治疗试验 BALB/C小鼠
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BVDV囊膜蛋白E2重组腺病毒的构建及免疫效果研究
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作者 吕雯雯 塞力克·杰恩斯 +4 位作者 叶鸿艳 张亚平 刘芯怡 史慧君 付强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1065-1071,共7页
为构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)囊膜蛋白E2重组腺病毒并分析其免疫效果。本研究通过PCR扩增获得目的基因BVDV E2,将其与穿梭载体pDC316-CMV-EFla-copGFP连接得到重组腺病毒载体,抽提质粒后酶切鉴定。将目的质粒与腺病毒骨架质粒p BHGlox-... 为构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)囊膜蛋白E2重组腺病毒并分析其免疫效果。本研究通过PCR扩增获得目的基因BVDV E2,将其与穿梭载体pDC316-CMV-EFla-copGFP连接得到重组腺病毒载体,抽提质粒后酶切鉴定。将目的质粒与腺病毒骨架质粒p BHGlox-?E1,3cre采用AdMax系统共转染至Low Passage 293细胞中得到重组腺病毒rAdv-E2,同时包装重组腺病毒rAdv-EGFP用于阴性对照并均经PCR和测序鉴定;将重组腺病毒rAdv-E2和rAdv-EGFP分别感染Low Passage 293细胞后扩繁,并采用RT-PCR和TCID50检测目的基因的表达及腺病毒滴度;将BVDV E2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,使用IPTG诱导表达后经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化获得重组E2蛋白(rE2),用于后续特异性抗体的检测;以1×108TCID50/只分别将重组腺病毒r Adv-E2和r Adv-EGFP经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,分别于第0、14 d两次免疫,首免后分别于7 d、14 d、21 d、28 d断尾采血,通过间接ELISA方法检测各组小鼠血清抗体水平;于首免后21 d时分别以BVDV TC株攻毒,于攻毒后0、5 d、10 d及15 d从各组小鼠中随机剖杀3只,取肝脏、肺脏、肾脏组织,使用福尔马林溶液固定小鼠各组织后,经脱水浸蜡、包埋、切片、HE染色后观察攻毒后各组小鼠的组织病理变化情况。结果显示,RT-PCR鉴定结果表明重组腺病毒r Adv-E2表达E2基因;ELISA检测结果显示,rAdv-E2组小鼠在免疫后7 d、14 d、21 d时抗体水平升高,28 d时显著升高,rAdv-EGFP组小鼠抗体水平无明显变化,rAdv-E2组小鼠的抗体水平整体极显著高于rAdv-EGFP组(P<0.001、P<0.0001),表明rAdv-E2诱导小鼠产生了良好的体液免疫反应;组织病理切片观察结果显示,BVDV攻毒后,接种rAdv-EGFP的对照组小鼠肝脏组织出现肝细胞变性坏死、水肿、炎性细胞增多,中央静脉有淤血产生;肺脏组织病变特征主要为肺泡破裂融合,炎性细胞浸润、出血、充血,黏膜� 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 囊膜蛋白E2 腺病毒载体 免疫效果 病理变化
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