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STAT1和组蛋白乙酰化修饰调控鸡lncRNA-BMP4转录研究
1
作者 高晓敏 周舒简 +7 位作者 陈晨 金晶 胡菜 张晨 左其生 张亚妮 陈国宏 李碧春 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第9期3321-3332,共12页
【目的】探讨影响鸡长链非编码RNA(long chain noncoding RNA,lncRNA)-骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)启动子转录的因素,并对调控lncRNA-BMP4特异表达的分子机制进行研究。【方法】以鸡肌肉基因组为模板,PCR扩增... 【目的】探讨影响鸡长链非编码RNA(long chain noncoding RNA,lncRNA)-骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)启动子转录的因素,并对调控lncRNA-BMP4特异表达的分子机制进行研究。【方法】以鸡肌肉基因组为模板,PCR扩增并克隆鸡lncRNA-BMP4的启动子区,构建lncRNA-BMP4-EFGP载体,对lncRNA-BMP4启动活性进行定性分析;通过染色体5′-末端缺失的方法和双荧光素酶系统检测筛选lncRNA-BMP4启动子核心区域。通过在线工具预测分析调控核心区域的潜在转录因子;利用点突变和双荧光素酶系统筛查真正影响lncRNA-BMP4的转录因子;通过表观修饰验证DNA甲基化、组蛋白乙酰化对lncRNA-BMP4的转录调控作用。【结果】试验成功扩增lncRNA-BMP4启动子片段1288 bp,与pEGFP-N1载体连接后转染鸡成纤维细胞系(DF-1)具有荧光表达,说明lncRNA-BMP4启动子有启动活性。染色体5′-末端缺失和双荧光素酶系统检测发现,核心启动子区域为―832~―651 bp,Jaspar数据库分析筛选到核心区域的转录因子有SOX17、CREB1及STAT1。双荧光素酶系统检测发现,STAT1可促进lncRNA-BMP4核心启动区域的活性;DNA甲基化抑制剂5′-Azacd对lncRNA-BMP4的转录活性未有任何影响,而组蛋白乙酰化抑制剂TSA可极显著提高其转录活性(P<0.01)。【结论】提示lncRNA-BMP4的转录活性受STAT1和组蛋白乙酰化的正调控,而DNA甲基化不影响其转录。研究结果为详细解析lncRNA-BMP4的功能和分子机制提供了理论依据。 展开更多
关键词 鸡 lncRNA 启动子 STAT1 表观遗传修饰
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鸡bmp4过表达和敲除载体构建及活性验证
2
作者 李婷婷 孙长花 +3 位作者 周舒简 金晶 张亚妮 左其生 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期31-34,共4页
在哺乳动物中,bmp4可以通过BMP信号通路调节原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)的形成,但其在鸡PGCs形成过程中的功能和机制仍不清晰。构建鸡bmp4的过表达及敲除载体,并转染DF-1细胞检测活性。通过同源重组技术构建pCDH-CMV-bmp... 在哺乳动物中,bmp4可以通过BMP信号通路调节原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)的形成,但其在鸡PGCs形成过程中的功能和机制仍不清晰。构建鸡bmp4的过表达及敲除载体,并转染DF-1细胞检测活性。通过同源重组技术构建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP重组载体,转染DF-1细胞,RT-qPCR检测bmp4的表达;根据bmp4 CDS序列设计3个敲除靶位点(gRNA),插入PGMLV-GM1构建gRNA序列的重组载体bmp4-sgRNA1、bmp4-sgRNA2和bmp4-sgRNA3。Cas9载体与bmp4-sgRNA载体共转染DF-1细胞,T7E1酶切和TA克隆试验检测敲除载体活性及敲除效率。扩增获得bmp4 CDS全长1546 bp,并成功构建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP载体,将其转染DF-1细胞后有绿色荧光表达(25.17%±0.007),RT-qPCR检测结果表明,与对照组相比转染pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP的细胞中bmp4显著上调(P<0.01)。3个gRNA重组载体构建成功,转染DF-1细胞后T7E1酶切检测均有敲除活性,TA克隆结果显示敲除效率分别为6.25%、12.5%和18.75%。结果说明鸡bmp4过表达及敲除载体构建成功,可为后期bmp4功能验证及机制解析等研究提供技术支持。 展开更多
关键词 鸡 BMP4 过表达载体 敲除载体
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