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OpaR对副溶血弧菌pilABCD操纵子的调控研究 被引量：2
1
作者 陆仁飞 孙君芳 +4 位作者 薛星帆 张苗苗 李雪 吴齐敏 张义全 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期906-911,共6页
目的研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子OpaR对pilABCD的转录。方法提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和opaR突变株(ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究OpaR对pilA(pilABCD... 目的研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子OpaR对pilABCD的转录。方法提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和opaR突变株(ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究OpaR对pilA(pilABCD首基因)的转录调控;将pilABCD上游调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和ΔopaR中制备LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合试验研究OpaR对pilA的调控以及pilA的时相表达。提取WT株总RNA,采用引物延伸试验研究pilABCD的转录起始位点;PCR扩增pilABCD上游调控区DNA序列,并纯化His-OpaR蛋白,通过凝胶阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究His-OpaR与靶DNA片段是否有直接的结合作用,并进一步采用DNaseⅠ足迹试验分析其结合位点。结果qPCR和LacZ报告基因融合试验显示OpaR对pilABCD的转录具有激活作用,pilA的表达水平随培养时间的延长而持续升高;引物延伸结果显示pilABCD只有一个转录起始位点T(-155);EMSA和DNaseⅠ足迹试验结果显示OpaR对位于pilA的翻译起始位点上游-246~-197 bp和-181~-131 bp之间的DNA序列具有结合活性。结论OpaR对pilABCD的转录具有直接的激活活性。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 群体感应 转录调控 OpaR pilABCD
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群体感应系统核心调控子对副溶血弧菌mshH基因的调控研究 被引量：1
2
作者 韩海霞 孙君芳 +6 位作者 张凌宇 张苗苗 薛星帆 吴齐敏 李雪 陆仁飞 张义全 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1795-1804,共10页
【目的】探究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对mshH基因的转录调控。【方法】提取特定条件下副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株(ΔaphA和ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative... 【目的】探究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对mshH基因的转录调控。【方法】提取特定条件下副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株(ΔaphA和ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究AphA和OpaR对mshH基因的转录调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;将mshH启动子区DNA序列克隆入pHRP309质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,构建LacZ重组质粒,并将其转入WT、ΔaphA和ΔopaR中,获得LacZ实验菌株,再通过LacZ报告基因融合实验研究AphA和OpaR对mshH基因的调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;PCR扩增mshH上游启动子区DNA序列,并纯化His-AphA和His-OpaR蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和DNase I足迹实验,研究体外条件下His-AphA和His-OpaR对靶基因启动子区DNA片段是否具有直接的结合作用以及具体的结合位点。【结果】mshH基因的表达水平随着培养时间的延长而升高;低细菌密度时,AphA抑制mshH基因的转录,但His-AphA对mshH启动子区DNA序列没有结合活性;高细菌密度时,OpaR对mshH基因的转录具有激活作用,His-OpaR对位于mshH基因的翻译起始位点上游–160至–80 bp和–58至–19 bp之间的DNA序列具有结合活性。【结论】低细菌密度时,AphA可能是通过间接方式抑制mshH基因的转录;高细菌密度时,OpaR直接结合到mshH调控区DNA片段上,并激活其转录。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 群体感应 调控 AphA OpaR mshH
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ToxR负调控副溶血弧菌中c-di-GMP的合成
3
作者 张苗苗 薛星帆 +6 位作者 孙君芳 吴齐敏 李雪 周冬生 倪斌 陆仁飞 张义全 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4719-4730,共12页
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存... 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使,参与调控细菌的多种生物学行为包括生物膜的形成。本文探究ToxR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控作用。利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中c-di-GMP水平的差异。挑选c-di-GMP代谢相关基因scrA、scrG和vpa0198为进一步研究的靶标,采用实时定量qPCR实验检测靶基因在WT和ΔtoxR中的转录水平差异;将靶基因调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中无启动子的β半乳糖苷酶基因上游,采用lacZ报告基因融合实验进一步研究ToxR对靶基因的转录调控关系;将重组质粒分别导入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100λpir中,采用lacZ报告基因融合实验研究ToxR是否能在异体宿主中调控靶基因的表达;PCR扩增靶基因上游调控区DNA序列,并纯化His-ToxR蛋白,用凝胶阻滞实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-ToxR与靶基因启动子区DNA序列是否具有结合作用。ELISA结果显示ΔtoxR中c-di-GMP含量显著性高于WT中的,说明ToxR抑制c-di-GMP的产生;实时定量qPCR结果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的转录水平显著性高于ΔtoxR中的,表明ToxR抑制它们的转录;lacZ报告基因融合实验结果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100λpir中scrA、scrG和vpa0198的启动子区活性;EMSA实验显示His-ToxR能特异性地结合到scrA和scrG的上游调控区DNA序列上,而对vpa0198的上游调控区DNA序列无结合作用。综上所述,ToxR通过直接调控相关酶蛋白基因的转录来抑制副溶血弧菌内c-di-GMP的合成,从而有助于精确调控生物膜形成等细菌行为。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 转录调控 ToxR C-DI-GMP
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QsvR对副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1相关基因的转录调控
4
作者 吴燕 仇越 +4 位作者 吴齐敏 张苗苗 李雪 张义全 陆仁飞 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期597-606,共10页
【目的】研究调控蛋白QsvR对副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1(typeⅥsecretion system 1,T6SS1)相关基因的转录调控关系。【方法】提取野生株(wild type,WT)和qsvR突变株(ΔqsvR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究... 【目的】研究调控蛋白QsvR对副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1(typeⅥsecretion system 1,T6SS1)相关基因的转录调控关系。【方法】提取野生株(wild type,WT)和qsvR突变株(ΔqsvR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究QsvR对靶基因的调控关系;进而采用引物延伸法定位靶基因的转录起始位点和核心启动子区,并根据引物延伸产物丰度判断QsvR对靶基因的调控关系;将靶基因的调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中的β-半乳糖苷酶基因上游(LacZ重组质粒),并将重组质粒转化入WT和ΔqsvR中,通过LacZ报告基因融合试验研究QsvR对靶基因的调控关系;将LacZ重组质粒分别转化入含有pBAD33或pBAD33-qsvR的大肠杆菌100λpir中,进一步采用LacZ报告基因融合试验研究在异体宿主中QsvR对靶基因的调控关系;PCR扩增靶基因调控区DNA序列,同时表达并纯化His-QsvR重组蛋白,采用凝胶阻滞试验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-QsvR对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作用。【结果】qPCR结果显示,与WT相比,ΔqsvR中T6SS1相关基因VP1388(操纵子VP1388-1390首基因)和hcp1(操纵子VP1393-1406首基因)的转录水平显著性升高,表明QsvR抑制VP1388和hcp1的转录;引物延伸结果显示VP1388和hcp1各有一个转录起始位点,分别为C(-64)和T(-62),且它们的转录活性受QsvR的抑制;LacZ报告基因融合试验结果显示QsvR可以抑制副溶血弧菌和EC100λpir中VP1388和hcp1的启动子区转录活性;EMSA结果显示His-QsvR对VP1388和hcp1的启动子区DNA序列具有直接的结合活性。【结论】QsvR对T6SS1相关操纵子VP1388-1390和VP1393-1406的转录具有直接的抑制作用。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 QsvR Ⅵ型分泌系统1(T6SS1) 转录调控
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盐度和温度对创伤弧菌生长、运动及生物膜形成的影响
5
作者 张婷婷 吴齐敏 +4 位作者 吴飞 李雪 张义全 陆仁飞 周敏 《昆明理工大学学报（自然科学版）》 北大核心 2023年第6期97-102,共6页
研究盐度和温度对创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)的生长、运动及生物膜形成是否具有调控作用.控制盐度(0.5%、1%、2%、3%和4%NaCl)和温度(37℃和26℃)条件,通过测定创伤弧菌在肉汤培养基(Luria-Bertani medium,LB)中的生长曲线,来分析盐... 研究盐度和温度对创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)的生长、运动及生物膜形成是否具有调控作用.控制盐度(0.5%、1%、2%、3%和4%NaCl)和温度(37℃和26℃)条件,通过测定创伤弧菌在肉汤培养基(Luria-Bertani medium,LB)中的生长曲线,来分析盐度和温度对其生长的影响;将创伤弧菌接种于软琼脂平板上,通过比较不同盐度和温度下的菌苔直径差异,来分析盐度和温度对创伤弧菌运动能力的影响;通过结晶紫染色实验检测创伤弧菌在不同盐度和温度下的生物膜形成能力差异.创伤弧菌能够在0.5%~4%的盐浓度下生长,1%盐浓度是其最适宜生长盐度;1%盐浓度时创伤弧菌运动能力最强,而4%盐浓度时其生物膜形成能力最强;与26℃相比,37℃下创伤弧菌的生长、运动和生物膜形成能力均显著增强.盐度和温度能够调控创伤弧菌的生长、运动及生物膜形成. 展开更多
关键词 创伤弧菌 生长 运动 生物膜 盐度 温度
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