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大肠杆菌O157∶H7多糖-重组铜绿假单胞菌外毒素A结合疫苗的研制 被引量：7
1
作者 王燕 吴朝今 +7 位作者 杜送田 蒋奕 雍元 李岷松 赵志强 蒋仁生 杜琳 谢贵林 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第11期905-909,共5页
目的　用大肠杆菌O15 7∶H7(EscherichiacoliO15 7∶H7,E .coliO15 7)的一个重要保护性抗原即菌体脂多糖 (LPS)制备有效的候选疫苗。方法　选用Westphal热酚法提纯E .coliO15 7∶H7的LPS ,经酸水解法进一步脱毒处理后得到无毒但却具弱... 目的　用大肠杆菌O15 7∶H7(EscherichiacoliO15 7∶H7,E .coliO15 7)的一个重要保护性抗原即菌体脂多糖 (LPS)制备有效的候选疫苗。方法　选用Westphal热酚法提纯E .coliO15 7∶H7的LPS ,经酸水解法进一步脱毒处理后得到无毒但却具弱免疫原性的O 特异性多糖 (O SP) ,然后采用己二酸二肼 (ADH)将其共价结合到琥珀酰化 (或没琥珀酰化 )重组铜绿假单胞菌外毒素 (rEPAsucc或rE PA)上。结果　制备得到的E .coliO15 7∶H7的O SP rEPAsucc或O SP rEPA结合疫苗是安全有效的 ,其免疫原性要比单一O SP的免疫原性强 ,免疫小鼠后产生的血清抗LPSIgG抗体滴度比单一O SP免疫后产生的抗体水平均有显著性升高 (P <0 .0 1) ,且再次注射后存在加强应答。结论　E .coliO15 7∶H7的O SP rEPAsucc结合疫苗可望作为一种预防肠出血性E . 展开更多
关键词 结合疫苗 大肠杆菌O157:H7 铜绿假单胞菌 LPS E.coli 外毒素A 多糖 EPA 共价结合 ADH
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宋内氏痢疾菌无毒株S7表达Vi抗原工程菌的构建 被引量：2
2
作者 扈晶 董勇前 +2 位作者 吴朝今 沈玉霖 王秉瑞 《微生物学免疫学进展》 1996年第4期1-6,共6页
将含有编码Ｖｉ抗原ＶｉａＢ基因片断的质粒转导进入宋内氏痢菌无毒株Ｓ７中，组建了重组菌株Ｓ７Ｖｉ。质粒电泳图谱显示重组菌株Ｓ７Ｖｉ中存在被转入的外源质粒带。重组株的生化特性没有改变。菌体凝集及Ｖｉ抗血清标记的ＳＰＡ菌液... 将含有编码Ｖｉ抗原ＶｉａＢ基因片断的质粒转导进入宋内氏痢菌无毒株Ｓ７中，组建了重组菌株Ｓ７Ｖｉ。质粒电泳图谱显示重组菌株Ｓ７Ｖｉ中存在被转入的外源质粒带。重组株的生化特性没有改变。菌体凝集及Ｖｉ抗血清标记的ＳＰＡ菌液凝集反应证明在重组株的菌体表面，同时表达了Ｖｉ抗原和内氏痢疾菌的Ｏ抗原。以５×１０＾８ＣＦＵ、１０×１０＾８ＣＦＵ的重组株免疫近交系的ＬＩＢＰ小鼠。 展开更多
关键词 宋内氏痢疾菌 菌苗受体 VI抗原 研制
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非O1群霍乱弧菌O139型荚膜多糖的制备及生物学特性 被引量：1
3
作者 李生迪 张萍 +2 位作者 吴朝今 杜琳 王秉瑞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2001年第3期146-148,共3页
目的 提取Ｏ１３９型霍乱弧菌荚膜多糖，并检测其理化特性及免疫原性。方法 采用Ｃａｔａｖｌｏｎ、冷 酚、不同浓度乙醇沉淀、离心等步骤精制Ｏ１３９霍乱弧菌荚膜多糖，用生物学、免疫学等方法分析检定。结果 提取 的霍乱Ｏ１３９型... 目的 提取Ｏ１３９型霍乱弧菌荚膜多糖，并检测其理化特性及免疫原性。方法 采用Ｃａｔａｖｌｏｎ、冷 酚、不同浓度乙醇沉淀、离心等步骤精制Ｏ１３９霍乱弧菌荚膜多糖，用生物学、免疫学等方法分析检定。结果 提取 的霍乱Ｏ１３９型荚膜多糖具有良好的多糖特性、结构特征和免疫原性。结论 为组分疫苗的研制打下基础。 展开更多
关键词 O139型霍乱弧菌 荚膜多糖 生物学特性 制备
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重组H21G蛋白衍生物的制备及其免疫原性
4
作者 李燕婷 范锋锋 +6 位作者 吴朝今 罗树权 方红春 胡浩 于旭博 谢贵林 赵志强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第10期1253-1257,1262,共6页
目的分析重组H21G蛋白的化学修饰方法及化学修饰与免疫原性之间的相关性。方法应用琥珀酸酐和己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)分别修饰重组H21G蛋白制备衍生物,赖氨酸单位减少率法测定重组H21G蛋白琥珀酰化物的琥珀酰化率;2,... 目的分析重组H21G蛋白的化学修饰方法及化学修饰与免疫原性之间的相关性。方法应用琥珀酸酐和己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)分别修饰重组H21G蛋白制备衍生物,赖氨酸单位减少率法测定重组H21G蛋白琥珀酰化物的琥珀酰化率;2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)法测定重组H21G蛋白衍生物的-AH衍生率;SDS-PAGE及HPLC法分析重组H21G蛋白各衍生物的纯度及分子量分布。用各衍生物分别经皮下免疫小鼠,免疫浓度为25μg/ml,共免疫3次,于末次免疫后2周,经小鼠眼眶采血,分离血清,采用间接ELISA法检测血清IgG含量。采用非还原型SDS-PAGE分析重组H21G蛋白衍生物在制备初期、制备后4℃储存2周及6个月的稳定性。结果随着重组H21G蛋白与琥珀酸酐质量比(10∶1、10∶3、10∶4和10∶5)的提高,琥珀酰化率也逐渐升高,但质量比为10∶4和10∶5时无明显差异。重组H21G蛋白ADH衍生1和2 h的衍生率无明显差异。质量比为10∶4及10∶5的琥珀酰化物与原蛋白分子量分布差异较大;ADH衍生后,原蛋白的分子量分布也发生改变。重组H21G蛋白与琥珀酸酐质量比高于10∶3时,对蛋白的降解作用明显,当质量比达到10∶5时,重组H21G蛋白几乎不再以单体形式存在;而ADH衍生1和2 h对蛋白聚合作用无明显差异,均产生了二聚体和多聚体。重组H21G蛋白及其衍生物免疫小鼠后表现明显的剂次加强效应,且ADH衍生的产物的免疫原性高于琥珀酰化产物。琥珀酰化产物的稳定性较差,目标蛋白均明显降解,而ADH衍生的产物在4℃储存6个月后未见明显聚合或降解。结论重组H21G蛋白经ADH衍生的产物免疫原性及稳定性均优于琥珀酰化产物。 展开更多
关键词 H21G蛋白 琥珀酰化 ADH 衍生 免疫原性 稳定性
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小鼠血清中杀O139霍乱弧菌抗体检测方法的初步建立
5
作者 范锋锋 谭小梅 +6 位作者 李燕婷 吴朝今 刘月萍 乔瑞洁 王浩 赵志强 谢贵林 《微生物学免疫学进展》 2014年第6期24-30,共7页
目的研究探索O139霍乱弧菌杀弧菌抗体的检测方法。方法用微孔板培养和琼脂平板克隆计数相结合的杀弧菌抗体检测方法,对实验菌株及稀释度、补体浓度等关键参数进行筛选;对50份小鼠免疫血清进行杀弧菌抗体滴度检测,并与O139群霍乱弧菌LPS ... 目的研究探索O139霍乱弧菌杀弧菌抗体的检测方法。方法用微孔板培养和琼脂平板克隆计数相结合的杀弧菌抗体检测方法,对实验菌株及稀释度、补体浓度等关键参数进行筛选;对50份小鼠免疫血清进行杀弧菌抗体滴度检测,并与O139群霍乱弧菌LPS Ig G抗体滴度进行相关分析;对该方法的特异性、线性和精密性进行了验证。结果筛选出最佳菌株为20100603菌株,最佳稀释度倍数为2 000倍,补体最佳稀释倍数为16倍。O139群霍乱弧菌小鼠免疫血清检测到较高的杀弧菌抗体滴度而PBS小鼠免疫血清未检测到杀弧菌抗体滴度。小鼠免疫血清杀弧菌抗体滴度与O139群霍乱弧菌LPS Ig G抗体滴度之间存在正相关关系。验证结果显示,在抑制剂浓度达到1.0～2.0 A600时,抑制率100%;线性回归方程为y=-1.093x＋5.058,其相关系数为-0.999,P〈0.05;方法批内CV值为15.72%,批间CV值为23.47%。结论初步建立了O139霍乱弧菌杀弧菌抗体的检测方法,该方法具有较高的特异性、线性和精密度。 展开更多
关键词 霍乱 霍乱弧菌 O139 小鼠免疫血清 杀弧菌抗体 滴度
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免疫单扩散法测定重组铜绿假单胞菌外毒素A蛋白含量方法的建立及其应用
6
作者 李燕婷 范锋锋 +5 位作者 冯宜扬 金鑫 吴朝今 赵志强 谢贵林 谭小梅 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第20期2346-2351,共6页
目的:探索建立免疫单扩散法测定不同料液中重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)蛋白含量新方法。方法:对缓冲液系统、最佳抗体浓度和最佳观测时间等关键因素进行摸索,确定方法的最佳条件。... 目的:探索建立免疫单扩散法测定不同料液中重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)蛋白含量新方法。方法:对缓冲液系统、最佳抗体浓度和最佳观测时间等关键因素进行摸索,确定方法的最佳条件。在此基础上,对该方法的专属性、精密度、准确性和标准曲线的可靠性进行验证,并将该方法应用于r EPA柱层析纯化中不同样品目标蛋白含量的测定及回收率计算。结果:最佳缓冲系统为0.85%Na Cl溶液,最佳抗体用量为50μL·m L-1,最佳观测计算时间为4 h。方法具有较好的专属性、精密度、准确性和线性。结论:初步建立了免疫单扩散试验测定不同料液中r EPA蛋白含量新方法,为其纯化工艺的优化奠定了基础。 展开更多
关键词 免疫单扩散法 方法验证 重组铜绿假单胞菌外毒素A 蛋白质纯化 收率
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糖蛋白结合疫苗制备中载体蛋白琥珀酰化程度定量检测方法的建立
7
作者 王燕 吴朝今 +4 位作者 蒋奕 雍元 何向东 杜琳 谢贵林 《微生物学免疫学进展》 2002年第4期26-28,共3页
糖蛋白结合疫苗制备中赖氨酸单位减少率 (或赖氨酸单位替代率 )是衡量载体蛋白琥珀酰化程度的一个重要指标。本文建立了一种方便易行的化学检测方法 ,即氨基定量测定法 (简称改良Fields法 ) ,它是通过对琥珀酰化处理前和处理后载体蛋白... 糖蛋白结合疫苗制备中赖氨酸单位减少率 (或赖氨酸单位替代率 )是衡量载体蛋白琥珀酰化程度的一个重要指标。本文建立了一种方便易行的化学检测方法 ,即氨基定量测定法 (简称改良Fields法 ) ,它是通过对琥珀酰化处理前和处理后载体蛋白中赖氨酸的ε一氨基的定量测定 ,间接计算出赖氨酸单位减少率大小的。经测试该方法中标准赖氨酸浓度的测试灵敏度范围在 0 .5～ 40 μg。同时用已知不同浓度赖氨酸和三批待测琥珀酰化载体蛋白进行验证 。 展开更多
关键词 糖蛋白结合疫苗 制备 载体蛋白 定量检测方法 琥珀酰化 赖氨酸单位减少率 改良Fields法
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白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化
8
作者 范锋锋 李燕婷 +8 位作者 金鑫 刘月萍 吴朝今 冯宜扬 乔瑞洁 许博 赵志强 谭小梅 谢贵林 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第12期1262-1266,共5页
目的原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础。方法以p ET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至p ET22b载体中,构建重组原核表达质粒p ET22b-H21G,转化感受态大... 目的原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础。方法以p ET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至p ET22b载体中,构建重组原核表达质粒p ET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达。重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF（high sub）疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列。结果重组原核分泌性表达质粒p ET22b-H21G经双酶切（NcoⅠ和XhoⅠ）和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10%-15%;经纯化后,重组蛋白纯度达95%以上,等电点在4.55-6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合。结论成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 白喉毒素 无毒突变体H21G 分泌性表达 纯化
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