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sPD-L1蛋白原核表达、纯化及鉴定 被引量：3
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作者 鲁友铭 吴胜昔 +3 位作者 侯力嘉 王桂玲 马培杰 卢琬薪 《重庆理工大学学报（自然科学）》 CAS 北大核心 2020年第11期199-206,共8页
为实现人可溶性程序性死亡因子配体1(solubleprogrammeddeathligand-1,sPD-L1)在原核表达系统的高效表达,根据GenBank发表的sPD-L1(GenBank登录号:AY254342.1)基因序列,在不改变sPD-L蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性... 为实现人可溶性程序性死亡因子配体1(solubleprogrammeddeathligand-1,sPD-L1)在原核表达系统的高效表达,根据GenBank发表的sPD-L1(GenBank登录号:AY254342.1)基因序列,在不改变sPD-L蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,化学合成PD-L1胞外域基因全长序列,克隆至质粒载体pET28a(+),转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)进行诱导表达,利用镍柱对目的蛋白进行纯化。纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE电泳、蛋白免疫印迹和酶联免疫吸附试验进行生物特性鉴定。结果表明:重组质粒经过NcoI、XholI双酶切鉴定显示在668bp处有一条特异性条带,与预期相符;当诱导条件为0.5 mmol/LIPTG、37℃、9h时,重组蛋白具有最高表达量。纯化产物经过Westernblot鉴定,结果显示在28KD左右有明显蛋白条带出现,而空白对照组则无条带。ELISA鉴定结果显示其可以与进口小鼠抗人PD-L1单克隆抗体发生较强的反应,说明已成功实现了在大肠杆菌中高效表达sPD-L1重组蛋白,可为后续开展sPD-L1检测方法的研究奠定基础。 展开更多
关键词 可溶性程序性死亡因子配体1 原核表达 镍柱纯化 蛋白免疫印迹 酶联免疫吸附试验
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甲胎蛋白单克隆抗体制备及微粒操控检测方法建立
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作者 王桂玲 吴胜昔 +7 位作者 冉皑 刘晓竹 谷志鹏 马培杰 卢琬薪 黄蕾 杨溪 柴伟娜 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期629-638,共10页
目的制备甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)单克隆抗体并鉴定其生物学特性,以该抗体初步建立基于微粒操控技术的AFP抗原快速检测方法。方法以重组表达的AFP蛋白为免疫原,腹腔免疫8周龄雌性Balb/c小鼠。取4次免疫后小鼠的脾细胞,以PEG150... 目的制备甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)单克隆抗体并鉴定其生物学特性,以该抗体初步建立基于微粒操控技术的AFP抗原快速检测方法。方法以重组表达的AFP蛋白为免疫原,腹腔免疫8周龄雌性Balb/c小鼠。取4次免疫后小鼠的脾细胞,以PEG1500为诱导剂与骨髓瘤细胞进行融合,筛选分泌AFP抗体的单克隆杂交瘤细胞株,将该细胞株注射Balb/c小鼠并制备AFP单抗。将制备的AFP单抗固定于微电极芯片表面,通过交流动电效应加速AFP抗原富集到微电极芯片并与AFP单抗发生特异性的免疫结合反应,芯片连接阻抗仪即可监测免疫反应情况,初步建立基于交流动电效应与阻抗免疫传感相结合的AFP抗原检测方法,并对该方法进行评价。结果共筛得7株能稳定分泌抗AFP单抗的杂交瘤细胞株,诱导的小鼠腹水型抗体效价达到1∶2048000以上。建立了基于微粒操控技术的AFP抗原快速检测方法。检测芯片的最佳清洗方式是:异丙醇超声清洗10 min→无水乙醇超声清洗10 min→超纯水超声清洗10 min;AFP抗体的最佳包被条件是10μg/ml、37℃、1 h。微粒操控技术检测AFP抗原加标血清的下限达1 ng/ml,肝癌血清样品的检出阳性率达95%,特异性(检出阴性率)达96.7%。结论制备了特异性、高效价的AFP单克隆抗体,以此AFP抗体建立的微粒操控技术具有良好的特异性、重复性及较高的灵敏度,无复杂的数据处理及反复清洗步骤,以较低的成本实现血清肝癌标志物AFP在1 min内快速完成现场检测,具有较高的临床应用价值,为肝癌的早期诊断提供了一种新的检测技术。 展开更多
关键词 肝癌 AFP单克隆抗体 交流动电效应 微粒操控技术
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