绵羊肺腺瘤病特异性PCR及套式PCR诊断方法的建立 被引量：4

1

作者 罗军荣 刘霄卉 +3 位作者 余群英 张淑琴 周建华 马学恩 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期125-130,共6页

绵羊肺腺瘤是由外源性反转录病毒JSRV引起的接触性传染的肺肿瘤性疾病。感染羊没有针对JSRV的循环抗体,但在感染羊的肺肿瘤组织、淋巴网状系统及外周血单核细胞中可检测到外源性前病毒exJSRV及JSRV转录产物。健康羊基因组中存在15~20拷... 绵羊肺腺瘤是由外源性反转录病毒JSRV引起的接触性传染的肺肿瘤性疾病。感染羊没有针对JSRV的循环抗体,但在感染羊的肺肿瘤组织、淋巴网状系统及外周血单核细胞中可检测到外源性前病毒exJSRV及JSRV转录产物。健康羊基因组中存在15~20拷贝的内源性前病毒enJSRV,内外源性前病毒的结构基因高度相似,而在U3区存在差别,因而,设计了针对exJSRVU3区的特异性引物并在国内首次建立了一步法特异性PCR检测法及套式PCR检测法。以700ng健康羊基因组DNA为背景,梯度稀释阳性质粒pJSRV-LTR作为模板,比较两种方法的敏感性,结果表明套式法的敏感性是一步法的10倍以上,套式法也是目前可用于检测感染羊血液样品的唯一方法,可望在绵羊肺腺瘤病的流行病学调查及防控方面起重要作用。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤 绵羊肺腺瘤病毒 特异性PCR 套式PCR

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JSRV衣壳蛋白单克隆抗体的制备及免疫学鉴定 被引量：5

2

作者 罗军荣 斯日古楞 +2 位作者 刘霄卉 周建华 马学恩 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第1期108-114,共7页

经纯化的JSRV-CA融合蛋白乳化后免疫Balb/c小鼠,四免后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经杂交瘤技术进行融合.最终获得了三株稳定分泌单克隆抗体的细胞系.同时,分段克隆绵羊肺腺瘤病毒ca基因并构建原核表达质粒,在E.coliBL21中诱导表达.... 经纯化的JSRV-CA融合蛋白乳化后免疫Balb/c小鼠,四免后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经杂交瘤技术进行融合.最终获得了三株稳定分泌单克隆抗体的细胞系.同时,分段克隆绵羊肺腺瘤病毒ca基因并构建原核表达质粒,在E.coliBL21中诱导表达.以获得的三株抗JSRV-CA蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗,应用Western blot对分段表达的CA蛋白进行肽探针扫描,初步鉴定了三株单抗识别的线性表位,并应用非竞争性ELISA法测定了三株单抗的功能性亲和常数.为建立特异性的病原诊断方法、分析CA蛋白的功能及疫苗设计奠定了基础. 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 表位 衣壳蛋白 抗体亲和力 单克隆抗体

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内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与序列分析 被引量：3

3

作者 周艳喜 苏佳 +2 位作者 李靖 刘霄卉 马学恩 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期962-966,共5页

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7 519bp,与内源性... 参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7 519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971.1的核苷酸同源性为90.4%。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。 展开更多

关键词 内源性绵羊肺腺瘤病毒 PCR扩增 全基因序列

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绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因表面蛋白的表达及其单克隆抗体的制备 被引量：3

4

作者 刘霄卉 斯日古楞 +2 位作者 罗军荣 周建华 马学恩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期469-472,共4页

在E.coli BL21中诱导表达含有绵羊肺瘤病毒囊膜表面蛋白(SU)重组质粒pGEX-4T-1-SU,表达的GST融合蛋白经纯化后用佐剂乳化,作为抗原免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合、克隆化、ELISA法初步筛选抗SU单抗。最终获得了3株抗SU的单抗,为深入探... 在E.coli BL21中诱导表达含有绵羊肺瘤病毒囊膜表面蛋白(SU)重组质粒pGEX-4T-1-SU,表达的GST融合蛋白经纯化后用佐剂乳化,作为抗原免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合、克隆化、ELISA法初步筛选抗SU单抗。最终获得了3株抗SU的单抗,为深入探讨JSRV的分子生物学特性及研制诊断试剂盒打下了基础。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 囊膜基因 表面蛋白 原核表达 单克隆抗体

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绵羊肺腺瘤LAMP快速诊断方法的初步建立(英文) 被引量：2

5

作者 刘霄卉 于立新 +5 位作者 罗军荣 周艳喜 刘畅 幺宏强 周建华 马学恩 《内蒙古农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2013年第2期14-20,共7页

为了建立一种便捷、灵敏的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)检测技术,本研究根据exJSRV LTR设计2对特异性引物,建立JSRV的LAMP(loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增)检测方法,对反应体系中的MgSO4Betaine Bst DNA PoLymerase d... 为了建立一种便捷、灵敏的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)检测技术,本研究根据exJSRV LTR设计2对特异性引物,建立JSRV的LAMP(loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增)检测方法,对反应体系中的MgSO4Betaine Bst DNA PoLymerase dNTP引物浓度等分别进行了优化,并进行敏感性和特异性试验。结果表明:所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用60min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)的扩增结果为阴性,该方法对JSRV前病毒DNA的最小检测限为10拷贝,灵敏性高于一步PCR方法。LAMP和特异性PCR及套式PCR方法检测临床样品的符合率分别为92%和100%。该方法为绵羊肺腺瘤病的临床检测和基层检疫提供了一种简便、实用的方法,可望在绵羊肺腺瘤病的流行病学调查及防控方面起重要作用。基于本技术的专利已获国家知识产权局批准(专利号ZL 2012 1 0274280.7)。 展开更多

关键词 环介导等温扩增 绵羊肺腺瘤病毒 绵羊肺腺瘤 敏感性 组织

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绵羊肺腺瘤PCR诊断方法的建立及应用 被引量：2

6

作者 周艳喜 苏佳 +2 位作者 李靖 刘霄卉 马学恩 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第10期24-28,共5页

利用特异性PCR方法实现对绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)快速精确诊断和病毒类型的分析。参照GenBank中公布的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列,针对病毒env基因YXXM基序设计了特异性PCR引物,建立了特异性PCR检测方法。成功扩增出病毒囊膜基因(env)... 利用特异性PCR方法实现对绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)快速精确诊断和病毒类型的分析。参照GenBank中公布的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列,针对病毒env基因YXXM基序设计了特异性PCR引物,建立了特异性PCR检测方法。成功扩增出病毒囊膜基因(env)多变区序列片段(ST)通过序列比对确定病毒类型。此方法操作简便,可用于绵羊肺腺瘤的快速诊断,可望在绵羊肺腺瘤发病机制等研究中起到重要作用。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 聚合酶链反应 检测

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马传染性贫血病毒受体基因的原核表达 被引量：1

7

作者 张淑琴 罗军荣 +3 位作者 刘霄卉 杨旭艳 马学恩 周建华 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2008年第6期14-16,共3页

为了构建马传染性贫血病毒受体(ELR1)的原核表达体系,克隆ELR1的编码区基因,将其亚克隆到PET-30a构建重组表达质粒PET-30a-ELR1,经酶切和DNA测序鉴定,将阳性质粒转化E.coliBL21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳及Westhern-b... 为了构建马传染性贫血病毒受体(ELR1)的原核表达体系,克隆ELR1的编码区基因,将其亚克隆到PET-30a构建重组表达质粒PET-30a-ELR1,经酶切和DNA测序鉴定,将阳性质粒转化E.coliBL21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳及Westhern-blot分析鉴定,结果表明:该基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达,其表观分子质量约为39.6ku;利用尿素洗涤纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原。 展开更多

关键词 EIAV ELR1 原核表达

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稳定表达绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白A549细胞系的建立 被引量：1

8

作者 刘霄卉 罗军荣 +2 位作者 斯日古楞 周建华 马学恩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期395-398,共4页

为研究绵羊肺腺瘤病病毒(JSRV)表面蛋白(SU)的致瘤机制,本研究构建稳定表达SU的羊肺细胞A549细胞系。采用PCR方法从含su基因的pGEX-4T-1-SU重组质粒中扩增SU编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,转染A549细胞。通过G418筛选,... 为研究绵羊肺腺瘤病病毒(JSRV)表面蛋白(SU)的致瘤机制,本研究构建稳定表达SU的羊肺细胞A549细胞系。采用PCR方法从含su基因的pGEX-4T-1-SU重组质粒中扩增SU编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,转染A549细胞。通过G418筛选,对转染阳性细胞进行纯化,获得稳定表达JSRVSU蛋白的A549细胞系。以间接免疫荧光及westernblot鉴定SU的表达状况,并运用共聚焦显微镜确认SU蛋白的亚细胞定位。结果表明,重组蛋白SU在A549细胞中有效表达,而且主要分布于细胞质中。该细胞系的建立为SU生物学功能的体外研究提供了平台。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 表面蛋白 真核表达 细胞内定位

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羊Ⅱ型肺泡上皮细胞的分离培养及鉴定 被引量：1

9

作者 罗军荣 余群英 +5 位作者 刘霄卉 高华 武志红 周艳喜 周建华 马学恩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期741-744,共4页

为改进羊肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离和培养技术,本研究采用IgG黏附法结合磁化树脂微粒法分离纯化了山羊肺泡Ⅱ型上皮细胞,碱性磷酸酶染色检查表明Ⅱ型细胞占90%以上,台盼蓝染色活细胞为95%以上。羊肺泡Ⅱ型上皮细胞分离纯化方法的建立,为... 为改进羊肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离和培养技术,本研究采用IgG黏附法结合磁化树脂微粒法分离纯化了山羊肺泡Ⅱ型上皮细胞,碱性磷酸酶染色检查表明Ⅱ型细胞占90%以上,台盼蓝染色活细胞为95%以上。羊肺泡Ⅱ型上皮细胞分离纯化方法的建立,为今后体外分离培养绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的探索性工作奠定了基础,也为研究肺纤维化及肺癌发病机理等重大课题提供了重要的技术支持。 展开更多

关键词 肺泡Ⅱ型上皮细胞 分离 培养 鉴定

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1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒的序列测定与分析

10

作者 周艳喜 李靖 +4 位作者 敖威华 刘霄卉 于立新 幺宏强 马学恩 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期838-842,共5页

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结... 参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。 展开更多

关键词 山羊内源性肺腺瘤反转录病毒 全基因序列 PCR扩增

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绵羊ras基因第一、二外显子的扩增及序列测定

11

作者 刘霄卉 于立新 +2 位作者 刘畅 周建华 马学恩 《内蒙古农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2011年第4期14-18,共5页

对JSRV感染羊及健康绵羊H-ras、N-ras、K-ras基因第一、二外显子区克隆并测序,研究其变异状况。方法:本研究从JSRV感染羊及健康绵羊肺组织中提取基因组DNA,应用PCR技术扩增Hras、Nras、Kras基因第一、二外显子序列,并通过T-A克隆的方法... 对JSRV感染羊及健康绵羊H-ras、N-ras、K-ras基因第一、二外显子区克隆并测序,研究其变异状况。方法:本研究从JSRV感染羊及健康绵羊肺组织中提取基因组DNA,应用PCR技术扩增Hras、Nras、Kras基因第一、二外显子序列,并通过T-A克隆的方法将其克隆入pMD-18T载体中,鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定分析。结果:与其他物种ras基因相比,所克隆的ras基因与其他物种之间的差异率较小,基本保守,且与牛的ras基因同源性最高。所克隆的H-ras、K-ras基因在第一、二外显子区域序列完全相同;N-ras第81位氨基酸A-V的不同;但试验中检测的2例JSRV感染羊与健康绵羊的ras无论是在核酸水平上,还是在氨基酸水平上均未发现突变。结论:克隆测序了绵羊ras基因第一、二外显子,为下一步实验奠定了基础。 展开更多

关键词 RAS基因 第一、二外显子 克隆 序列分析

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表达绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白HepG2细胞系的建立

12

作者 刘霄卉 罗军荣 +2 位作者 斯日古楞 周建华 马学恩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期323-326,共4页

为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了... 为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA。通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系。间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达。JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤反转录病毒 跨膜蛋白 真核表达 HEPG2细胞系

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