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鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达 被引量：8
1
作者 刘深基 陈松森 +1 位作者 张松 狄旭 《基础医学与临床》 CSCD 1999年第3期89-93,共5页
用PCR的方法从含有鲑鱼降钙素基因的质粒中扩增出目的基因，并将其插入硫氧还原蛋白融合表达质粒pTrxFus中，转入大肠杆菌GI724，以色氨酸诱导，使之与硫氧还原蛋白融合表达，融合蛋白可占菌体总蛋白的50％左右。用超声破碎菌体后，上... 用PCR的方法从含有鲑鱼降钙素基因的质粒中扩增出目的基因，并将其插入硫氧还原蛋白融合表达质粒pTrxFus中，转入大肠杆菌GI724，以色氨酸诱导，使之与硫氧还原蛋白融合表达，融合蛋白可占菌体总蛋白的50％左右。用超声破碎菌体后，上清直接上CM－SepharoseFF柱进行分离纯化，得到融合蛋白的纯度达90％以上。动物体内活力分析表明，融合蛋白有明显的降低血钙的作用，此工作为重组鲑鱼降钙素的开发应用和功能研究打下了基础。 展开更多
关键词 鲑鱼降钙素 降钙素基因 可溶性 高效表达
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降钙素/降钙素基因相关肽基因前体RNA的加工 被引量：6
2
作者 刘深基 陈松森 《国外医学（分子生物学分册）》 CSCD 1999年第4期196-200,共5页
降钙素和降钙素基因相关肽是由一个基因表达出的两种功能完全不同的多肽激素,其基因的表达主要在RNA水平上受到调控。前体RNA在加工成为成熟RNA的过程中,在不同的组织中经过不同的剪接形成不同的RNA。其剪接的特异性受到顺式元件和反式... 降钙素和降钙素基因相关肽是由一个基因表达出的两种功能完全不同的多肽激素,其基因的表达主要在RNA水平上受到调控。前体RNA在加工成为成熟RNA的过程中,在不同的组织中经过不同的剪接形成不同的RNA。其剪接的特异性受到顺式元件和反式因子的调控,基因 的exon4上游剪接受点和下游polyA位点均存在弱的加工位点,通过增强子序列使之产生选择性剪接,另外,可能存在组织特异的反式剪接因子。 展开更多
关键词 降钙素 CGRP RNA 基因表达
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重组鲑鱼降钙素前体多肽的制备及其性质研究 被引量：3
3
作者 刘深基 陈松森 +2 位作者 狄旭 熊安琪 张友鸿 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 2000年第5期650-654,共5页
硫氧还原蛋白的第 38位 Met突变为 Ala的 Trx- s CT- Gly基因在 E.coli BL2 1 ( DE3)中得到高效表达 .用 Thio Bind亲和树脂纯化表达的融合蛋白 .结果说明 38位的 Met突变为 Ala不影响融合蛋白与树脂的特异性结合 ,融合蛋白的纯度达 90 ... 硫氧还原蛋白的第 38位 Met突变为 Ala的 Trx- s CT- Gly基因在 E.coli BL2 1 ( DE3)中得到高效表达 .用 Thio Bind亲和树脂纯化表达的融合蛋白 .结果说明 38位的 Met突变为 Ala不影响融合蛋白与树脂的特异性结合 ,融合蛋白的纯度达 90 %以上 .在含有 3mol/L尿素的 70 %甲酸中 ,室温 48h,至少 80 %融合蛋白被溴化氰裂解开 .采用 CM-纤维素吸附 ,用稀盐酸解吸附 ,得到纯度为92 %的降钙素前体多肽 s CT- Gly.氨基酸的序列分析结构表明 ,重组 s CT- Gly的 N端 1 0个氨基酸与预期一致 .在强酸性条件下 ,没有发生氨基酸的脱酰胺反应 ,氨基酸组成分析与预期基本一致 .质谱法测定的分子量为 3492 ,毛细管电泳测定的等电点 p I为 6.46,大鼠降钙素比活性为 1 90 IU/mg左右 ,与天然的人降钙素相当 . 展开更多
关键词 重组降钙素前体 制备 性质 基因工程药物
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一种新型人源化鲑鱼降钙素突变体的构建与表达 被引量：5
4
作者 刘深基 陈松森 +2 位作者 狄旭 熊安琪 张友鸿 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期351-355,共5页
目的 降低鲑鱼降钙素（sCT）对人体的免疫原性。方法 设计并合成人源化鲑鱼降钙素（11 ～ 17）hsCT基因，用基因重组方法构建表达载体，转入大肠杆菌G1724中，经色氨酸诱导表达；用渗透压法处理菌体纯化融合蛋白；以大鼠血清钙浓度降低... 目的 降低鲑鱼降钙素（sCT）对人体的免疫原性。方法 设计并合成人源化鲑鱼降钙素（11 ～ 17）hsCT基因，用基因重组方法构建表达载体，转入大肠杆菌G1724中，经色氨酸诱导表达；用渗透压法处理菌体纯化融合蛋白；以大鼠血清钙浓度降低方法测定hsCT生物活性；用定量Western blot法测定hsCT免疫原性。结果 重组pTrxFus-hsCT质粒在大肠杆菌中获得高效可溶性融合蛋白表达, 表达水平达46%以上, 并得到纯度约90%的融合蛋白,rhsCT保存了鲑鱼降钙素前体活性的一半以上, 免疫原性降低了55%。结论 获得一种新型人源化降钙素（11 ～ 17）hsCT，其保存较高sCT前体的活性，免疫原性明显降低。 展开更多
关键词 人源化降钙素 重组 免疫原性 生物活性
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硫氧还原蛋白突变基因用于鲑鱼降钙素的高效可溶性融合表达 被引量：1
5
作者 刘深基 陈松森 +2 位作者 狄旭 熊安琪 张友鸿 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2001年第1期24-27,共4页
为了化学裂解后重组多肽的分离纯化 ,用双引物定点突变的方法将表达质粒pTrx sCT Gly中硫氧还原蛋白 (Trx)与鲑鱼降钙素 (sCT)的融合基因的第 38位Met突变为Ala,并将突变后的基因克隆到pET30a中 ,然后转入大肠杆菌BL2 1,以IPTG诱导 ,使... 为了化学裂解后重组多肽的分离纯化 ,用双引物定点突变的方法将表达质粒pTrx sCT Gly中硫氧还原蛋白 (Trx)与鲑鱼降钙素 (sCT)的融合基因的第 38位Met突变为Ala,并将突变后的基因克隆到pET30a中 ,然后转入大肠杆菌BL2 1,以IPTG诱导 ,使降钙素与硫氧还原蛋白融合表达 ,融合蛋白占菌体总蛋白的 5 6 %左右。并发现本原核表达体系存在“表达渗漏”现象 ,此现象为在菌体的对数生长期中 ,外源蛋白极少表达 ,随着培养时间的延长 ,外源蛋白逐步积累 ,达到 5 1%的高水平。该发现在基因工程生产重组蛋白工艺中具有应用价值。 展开更多
关键词 鲑鱼降钙素 定点突变 高效表达 硫氧还原蛋白
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菌体表面表达与活菌疫苗
6
作者 刘深基 陈松森 《微生物学免疫学进展》 1998年第3期65-67,共3页
展示表达是将目的蛋白基因与细胞表面结构蛋白融合，使目的蛋白表达并锚定于细胞表面的一项技术，微生物特别是细菌常用作展示表达的宿主。在大肠杆菌中，多种外膜蛋白、鞭毛蛋白、菌毛蛋白、脂蛋白等均已被用于表达和锚定外源蛋白，革... 展示表达是将目的蛋白基因与细胞表面结构蛋白融合，使目的蛋白表达并锚定于细胞表面的一项技术，微生物特别是细菌常用作展示表达的宿主。在大肠杆菌中，多种外膜蛋白、鞭毛蛋白、菌毛蛋白、脂蛋白等均已被用于表达和锚定外源蛋白，革兰氏阴性菌中，较明确的是蛋白Ａ可用以细胞表面的整合，Ｍ６蛋白也被尝试用于乳酸菌的展示表达，酵母表达体系中，将目的蛋白与凝集素融合可表达细胞表面，菌体表面表达的蛋白容易被免疫系统识别，能引起强烈的免疫反应。其中沙门菌、大肠杆菌、链球菌等展示表达的致病细菌或病毒的抗原和毒素用于免疫动物均能产生高滴度的中和抗体，用作疫苗大有前途。 展开更多
关键词 菌体 表达体系 活菌疫苗
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人FL在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化和生物学活性测定 被引量：1
7
作者 张友鸿 周希亚 +4 位作者 陈松森 娄可佳 刘深基 杨克恭 何维 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2002年第2期125-129,共5页
建立人FL(humanflt3ligand ,hFL)在大肠杆菌中的高效表达系统 ,分离纯化重组hFL为其功能和应用研究打下基础。根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成hFL基因膜外区DNA片段 ,由PCR方法获得的hFL基因膜外区DNA片段 ,经测序证明序列正确。构建表... 建立人FL(humanflt3ligand ,hFL)在大肠杆菌中的高效表达系统 ,分离纯化重组hFL为其功能和应用研究打下基础。根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成hFL基因膜外区DNA片段 ,由PCR方法获得的hFL基因膜外区DNA片段 ,经测序证明序列正确。构建表达载体pET30a Trx hFL并转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,hFL融合蛋白的表达占菌体总蛋白的 6 0 %以上 ,并以包涵体形式存在。融合蛋白经离子交换层析、分子筛层析纯化 ,并用FXa切割 ,切割效率 >80 %。切割产物经亲和层析纯化。纯化产物进行Westernblot鉴定。纯化的rhFL(recombinanthFL)与GM CSF及TNFα联合作用 ,具有良好的刺激DC增殖活性 ,其增殖能力是GM CSF +TNFα的 2 5倍左右。本文以大肠杆菌为宿主 ,成功地表达了融合蛋白Trx hFL。经纯化的rhFL在体外与GM CSF及TNFα联合使用能有效地刺激人DC的增殖。 展开更多
关键词 大肠杆菌 FL 融合表达 FXa裂解 纯化
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多肽酰胺化酶的结构与功能 被引量：1
8
作者 刘深基 陈松森 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1999年第3期195-197,共3页
Ｃ端酰胺化是许多神经内分泌多肽重要的翻译后加工过程，是在酰胺化酶的催化下分两步进行的，ＰＨＭ和ＰＡＬ分别催化这两步反应．ＰＨＭ由两个结构相似的结构域组成，每个结构域均为九链β折叠组成的三明治样结构，分别由三个Ｈｉｓ或... Ｃ端酰胺化是许多神经内分泌多肽重要的翻译后加工过程，是在酰胺化酶的催化下分两步进行的，ＰＨＭ和ＰＡＬ分别催化这两步反应．ＰＨＭ由两个结构相似的结构域组成，每个结构域均为九链β折叠组成的三明治样结构，分别由三个Ｈｉｓ或两个Ｈｉｓ和一个Ｍｅｔ螯合一个Ｃｕ组成活性中心．在一个反应周期中，两个Ｃｕ分别独立地与抗坏血酸和分子氧发生单电子传递的氧化还原反应。 展开更多
关键词 多肽酰胺化酶 结构 机制
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