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脯氨酸-4-羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式-4-羟脯氨酸生物合成的作用 被引量:11
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作者 袁春伟 张震宇 《生物加工过程》 CAS CSCD 2014年第6期44-51,共8页
为了使脯氨酸-4-羟化酶基因在重组大肠杆菌中得到高表达,通过调整大肠杆菌密码子偏好性以及mRNA二级结构,使得脯氨酸-4-羟化酶基因得到优化。将优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因插入含有色氨酸串联启动子的p UC19质粒,构建重组质粒p UC19-pt... 为了使脯氨酸-4-羟化酶基因在重组大肠杆菌中得到高表达,通过调整大肠杆菌密码子偏好性以及mRNA二级结构,使得脯氨酸-4-羟化酶基因得到优化。将优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因插入含有色氨酸串联启动子的p UC19质粒,构建重组质粒p UC19-ptrp2-Hyp,并导入大肠杆菌BL21(DE3)中。在摇瓶水平,重组菌以L-脯氨酸为底物发酵8 h,可积累(0.492±0.034)g/L的反式-4-羟脯氨酸。在发酵罐水平,通过补料分批发酵来提高反式-4-羟脯氨酸的产量,当补糖速率为18 g/h时,反式-4-羟脯氨酸的产量高达42.5 g/L,反式-4-羟脯氨酸产率为0.966 g/(L·h)。 展开更多
关键词 重组大肠杆菌 脯氨酸 4 羟化酶 反式 4 羟脯氨酸 密码子优化 发酵 条件优化
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褪黑素对H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用 被引量:7
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作者 任茂贤 +3 位作者 李杨 蒋文凯 周志 杨民 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1093-1098,共6页
目的探讨褪黑素对H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用机制。方法取24 h内新生SD大鼠10只,采用组织块贴壁法提取原代成骨细胞并行差速贴壁提纯细胞。细胞传至第2代时行碱性磷酸酶及茜素红染色进行鉴定。将鉴定后的成骨细胞... 目的探讨褪黑素对H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用机制。方法取24 h内新生SD大鼠10只,采用组织块贴壁法提取原代成骨细胞并行差速贴壁提纯细胞。细胞传至第2代时行碱性磷酸酶及茜素红染色进行鉴定。将鉴定后的成骨细胞用不同浓度的H_(2)O_(2)作用不同时间并行CCK8试验检测细胞增殖情况。选择合适的浓度和时间建立氧化应激损伤模型,并用褪黑素及EX527进行干预。实验分为对照组、H_(2)O_(2)组、褪黑素组及EX527组。分别对四组细胞行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,检测四组细胞活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶含量,同时用流式细胞仪检测四组细胞凋亡率,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl2和成骨相关蛋白BMP2、RUNX2以及SIRT1和p66SHC的表达量。结果经鉴定,成功提取原代成骨细胞。CCK8结果显示,400μmol/L H_(2)O_(2)作用4 h成骨细胞活性降至52%,适宜用于建立氧化应激损伤模型。H_(2)O_(2)作用后成骨细胞活性及矿化能力降低,ROS含量、MDA含量升高,SOD活性降低,细胞凋亡率升高,伴随有SIRT1、BMP2、RUNX2、Bcl2表达降低,p66SHC和Bax表达升高。褪黑素预处理后缓解了H_(2)O_(2)对成骨细胞的氧化应激损伤作用,部分恢复了成骨细胞的活性及矿化能力,SIRT1抑制剂EX527能够逆转褪黑素的上述作用。结论褪黑素通过调节SIRT1/p66SHC通路来抑制H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞的氧化应激损伤并促进成骨。 展开更多
关键词 褪黑素 成骨细胞 氧化应激 骨质疏松 SIRT1/p66SHC通路
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曲古抑菌素A促进去卵巢大鼠钛植入物骨整合
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作者 周志 蒋文凯 +4 位作者 之义 李杨 任茂贤 杨民 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1266-1271,共6页
目的探讨TSA对去卵巢大鼠TI骨整合的影响。方法将30只健康3月龄雌性SD大鼠随机分为Sham组(n=5)和OVX组(n=25)。正常饲养3个月后,两组各选取5只大鼠处死,取股骨远端样本行Micro-CT和HE染色以鉴定是否成功建立骨质疏松模型。随后在OVX组... 目的探讨TSA对去卵巢大鼠TI骨整合的影响。方法将30只健康3月龄雌性SD大鼠随机分为Sham组(n=5)和OVX组(n=25)。正常饲养3个月后,两组各选取5只大鼠处死,取股骨远端样本行Micro-CT和HE染色以鉴定是否成功建立骨质疏松模型。随后在OVX组剩余大鼠双侧股骨干骺端植入直径1.5 mm TI,并将其分为2组:Control组(n=10)和TSA组(n=10)。连续给药4周。给药结束后处死全部大鼠并取股骨样本行Micro-CT扫描、HE染色以及Masson染色,ELISA法检测,拔钉实验。结果与Sham组对比,Micro-CT显示OVX组BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N降低(P<0.05),而Tb.Sp、SMI升高(P<0.05),HE染色显示OVX组骨小梁数量明显降低。与Control组对比,Micro-CT显示TSA组BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D均升高(P<0.05),而Tb.Sp、SMI降低(P<0.05),HE染色、Masson染色显示TSA组骨小梁数量、新生骨数量均升高,ELISA法检测结果显示TSA组OCN、BMP2均升高,拔钉实验显示TSA组TI轴向拔出力增大。结论TSA通过上调OCN、BMP2等成骨相关蛋白,促进骨小梁形成和新骨形成,进而改善去卵巢大鼠TI骨整合。 展开更多
关键词 曲古抑菌素A 去卵巢大鼠 钛植入物 骨质疏松 骨整合
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丙戊酸钠对羰基氰化物间氯苯腙诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用研究
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作者 蒋文凯 周志 +2 位作者 任茂贤 杨民 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期316-323,共8页
目的探讨丙戊酸钠(sodium valproic acid,VPA)对羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。方法新生SD大鼠10只,取颅骨采用组织块法分离培养成骨细胞并传代,对... 目的探讨丙戊酸钠(sodium valproic acid,VPA)对羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。方法新生SD大鼠10只,取颅骨采用组织块法分离培养成骨细胞并传代,对第1代细胞行ALP和茜素红染色鉴定。取第3代成骨细胞以2~18μmol/L CCCP分别培养2~18 min,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞成活率,并基于半抑制浓度原理选择合适浓度及培养时间用于制备成骨细胞氧化应激损伤模型;采用0~2.0 mmol/mL VPA培养12~72 h后,CCK-8检测细胞活性,选择合适浓度进行下一步处理。将第3代细胞随机分为4组,包括空白对照组(正常培养细胞)、CCCP组(参照选择的浓度及培养时间行CCCP处理)、VPA+CCCP组(参照选择的浓度及培养时间行VPA预处理+CCCP处理)、VPA+CCCP+ML385组(VPA预处理前用10μmol/L Nrf抑制剂ML385预处理2 h,其余处理方法同VPA+CCCP组)。上述处理完成后,取各组细胞检测氧化应激指标[活性氧(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)]、细胞凋亡率,并行ALP、茜素红染色,以及Western blot检测成骨相关蛋白(BMP-2、RUNX2)、抗凋亡家族蛋白(Bcl2)、凋亡核心蛋白[活化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、Bax]、通道蛋白(Nrf2)相对表达量。结果经鉴定分离培养细胞为成骨细胞。根据CCK-8法检测结果,选择10μmol/L CCCP作用10 min建立成骨细胞氧化应激损伤模型,以及浓度0.8 mmol/mL VPA作用24 h进行后续实验。与空白对照组相比,CCCP组成骨细胞活性及矿化能力降低,ROS、MDA含量升高,SOD活性降低,细胞凋亡率升高,同时BMP-2、RUNX2、Bcl2蛋白相对表达量降低,Cleaved-Caspase-3、Nrf2和Bax蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);VPA+CCCP组进一步经VPA处理后,CCCP对成骨细胞的氧化应激损伤作用缓解,上述指标呈恢复趋 展开更多
关键词 丙戊酸钠 成骨细胞 氧化应激 骨质疏松 Keap1/Nrf2/Are通路 大鼠
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不同浓度柠檬酸铁铵对骨缺损大鼠骨愈合的影响 被引量:2
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作者 任茂贤 +2 位作者 蒋文凯 周志 杨民 《广州医科大学学报》 2022年第4期6-12,共7页
目的:探讨不同浓度柠檬酸铁铵对骨缺损大鼠缺损区骨愈合作用的影响。方法:将不同浓度的柠檬酸铁铵(0、5、50 mg/kg,3 d)通过腹腔注射方式作用于实验大鼠,连续注射9周。ELISA法检测骨缺损大鼠血清,HE和Masson染色法检测骨缺损大鼠缺损区... 目的:探讨不同浓度柠檬酸铁铵对骨缺损大鼠缺损区骨愈合作用的影响。方法:将不同浓度的柠檬酸铁铵(0、5、50 mg/kg,3 d)通过腹腔注射方式作用于实验大鼠,连续注射9周。ELISA法检测骨缺损大鼠血清,HE和Masson染色法检测骨缺损大鼠缺损区骨小梁,免疫组织化学法检测骨缺损大鼠缺损区新生骨小梁,Micro⁃CT检测骨缺损大鼠缺损区骨愈合程度。结果:与对照组相比,低浓度柠檬酸铁铵组大鼠血清SI含量升高,骨形成相关蛋白OCN、PINP含量升高,骨吸收相关蛋白CTX⁃I含量降低,骨缺损区骨小梁较多,新生骨小梁含量较高,骨愈合程度较高(P<0.05)。与对照组相比,高浓度柠檬酸铁铵组大鼠血清SI含量升高,骨形成相关蛋白OCN、PINP含量降低,骨吸收相关蛋白CTX⁃I含量升高,大鼠骨缺损区骨小梁较少、新生骨小梁含量降低,骨愈合程度较低(P<0.05)。结论:低浓度柠檬酸铁铵可以通过促进骨小梁新生,进而促进骨缺损大鼠缺损区的骨愈合。高浓度柠檬酸铁铵可通过抑制骨小梁新生,进而抑制骨缺损大鼠缺损区的骨愈合。 展开更多
关键词 柠檬酸铁铵 大鼠 骨缺损 骨愈合
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辛伐他汀对丙戊酸钠干预下骨质疏松伴骨缺损愈合的影响 被引量:2
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作者 李杨 张若天 +2 位作者 任茂贤 杨民 《皖南医学院学报》 CAS 2021年第6期511-514,共4页
目的:探讨辛伐他汀(SIM)对丙戊酸钠(SVP)干预下骨质疏松大鼠的股骨骨缺损愈合的影响。方法:SPF级健康雌性SD大鼠40只,行双侧去卵巢手术(OVX)。随后在剩余大鼠双侧股骨干骺端建立直径2.5 mm的圆形骨缺损并将其随机分为3组,OVX组、SVP组、... 目的:探讨辛伐他汀(SIM)对丙戊酸钠(SVP)干预下骨质疏松大鼠的股骨骨缺损愈合的影响。方法:SPF级健康雌性SD大鼠40只,行双侧去卵巢手术(OVX)。随后在剩余大鼠双侧股骨干骺端建立直径2.5 mm的圆形骨缺损并将其随机分为3组,OVX组、SVP组、SVP+SIM组。所有大鼠在药物干预8周后行安乐死,收集股骨分别行Micro-CT扫描、骨应力学测试及骨组织切片染色分析。结果:SVP组与OVX组相比,大鼠股骨骨密度以及骨应力强度降低,股骨骨缺损延迟愈合,骨组织OCN、Col I表达下降;SVP+SIM组与SVP组相比骨组织的强度更高,股骨骨缺损恢复效果更佳,且OCN、Col I水平提高。结论:SVP治疗后的大鼠股骨骨密度以及骨应力强度降低,股骨骨缺损延迟愈合;而SIM的治疗可有效逆转SVP对骨质的负面效应,增强各组大鼠的骨密度及骨骼强度,促进大鼠股骨骨缺损愈合。 展开更多
关键词 抗癫痫药物 辛伐他汀 丙戊酸钠 骨质疏松 去卵巢大鼠
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putA与vgb基因对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响 被引量:3
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作者 张胜利 林凡 +3 位作者 张震宇 孙付保 夏紫薇 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1307-1316,共10页
反式-4-羟基-L-脯氨酸是在自然界中分布最广泛的一种羟脯氨酸,在医药、化工、食品和美容业等领域有广泛应用。为了在生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的过程中减少菌体对底物脯氨酸的降解,利用Red/ET同源重组系统敲除putA基因,并比... 反式-4-羟基-L-脯氨酸是在自然界中分布最广泛的一种羟脯氨酸,在医药、化工、食品和美容业等领域有广泛应用。为了在生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的过程中减少菌体对底物脯氨酸的降解,利用Red/ET同源重组系统敲除putA基因,并比较野生型菌株与缺失型菌株在不同培养基中的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量,再引入vgb基因,考察该基因对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。结果表明:putA基因的缺失能阻止菌体降解脯氨酸;碳源充足的情况下,GC培养基更有利于反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产;putA基因缺失型菌株能将被消耗的脯氨酸全部转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸;vgb基因的存在能显著提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。 展开更多
关键词 反式-4-羟基-L-脯氨酸 大肠杆菌 生物转化 基因敲除 透明颤菌血红蛋白
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刘合栋、方晓玲作品欣赏
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作者 方晓玲 《漫动作》 2023年第10期0008-0008,共1页
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