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表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析 被引量：2
1
作者 宗雪晴 赵贤杰 +8 位作者 胡俊冶 余肇锋 李国潮 何颍欣 黄云飞 马春全 李舜 李亚娟 付强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期611-620,共10页
猪圆环病毒2型(PCV2)常与马链球菌兽疫亚种(SEZ)混合感染。为构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ并分析其免疫原性,本研究通过PCR扩增PCV2 Cap基因和SEZ疫苗株ST171 Szp基因的上下游同源臂基因(Szp-up、Szp-down),将上述PCR产物分别与pMD19-... 猪圆环病毒2型(PCV2)常与马链球菌兽疫亚种(SEZ)混合感染。为构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ并分析其免疫原性,本研究通过PCR扩增PCV2 Cap基因和SEZ疫苗株ST171 Szp基因的上下游同源臂基因(Szp-up、Szp-down),将上述PCR产物分别与pMD19-T载体连接,分别构建重组质粒pMD19-T-Cap、pMD19-T-Szp-up和pMD19-T-Szp-down。将pMD19-T-Szp-up与pG+host5分别双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp-up;将pMD19-T-Szp-down与pG+host5-Szp-up分别经双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp。上述重组质粒均经酶切和测序鉴定正确后分别经BamH I酶切pG+host5-Szp载体和pMD19-T-Cap载体后构建重组载体pG+host5-PCV2-Cap-Szp,并使PCV2 Cap基因替换Szp基因的166 bp~783 bp。经酶切和测序鉴定正确后将该质粒电转化ST171感受态细胞,通过红霉素抗性板筛选重组SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171株。通过菌落计数分别绘制PCV2-Cap-Szp/ST171及其亲本菌株ST171的生长曲线;分别采用荧光定量PCR(qPCR)检测重组菌株Cap基因以及亲本菌株ST171 Szp基因的转录水平;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定重组菌株Cap蛋白的表达。结果显示,亲本菌株和重组菌株的生长曲线基本一致,重组菌株中Cap基因的转录水平与亲本菌株中Szp基因的转录水平相当,且其中的蛋白肽段与PCV2 Cap蛋白的肽段相符,表明插入Szp基因不影响ST171的生长特性,且重组菌中的Cap基因可以正常转录并能够表达Cap蛋白。分别经小鼠腹腔接种不同剂量的重组菌株及亲本菌株,并采用改良寇氏法(Karber氏法)计算两株菌对小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示,重组菌株及亲本菌株对小鼠的LD50分别为3.21×108 cfu/mL及2.0×10^(7) cfu/mL,虽然前者对小鼠的LD50有所升高,但其对小鼠的致病性并未增强。将重组菌株及亲本菌株灭活乳化后与商品化的PCV2灭活疫苗分别免疫小鼠,0.5 mL/只,二免后14 d采用间接ELISA检测各组小鼠血清中的Cap蛋白抗体水平,结果 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 马链球菌兽疫亚种 重组菌株
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马链球菌兽疫亚种SclE蛋白原核表达;及其免疫效力评价 被引量：2
2
作者 徐宇萌 郭政 +4 位作者 李亚娟 邓静飞 何颍欣 黄云飞 付强 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期2465-2473,共9页
【目的】探究马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ)表面蛋白SclE的免疫效力,为预防SEZ引起的链球菌病提供理论依据。【方法】采用PCR扩增SEZ的SclE基因,再将该片段克隆至原核表达pCold I载体上,然后转化大肠杆菌... 【目的】探究马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ)表面蛋白SclE的免疫效力,为预防SEZ引起的链球菌病提供理论依据。【方法】采用PCR扩增SEZ的SclE基因,再将该片段克隆至原核表达pCold I载体上,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后以SDS-PAGE进行分析鉴定,获得的重组蛋白SclE(rSclE)(100μg/mL,0.5 mL)以腹腔注射形式免疫BALB/c小鼠(n=10,一免、二免的周期均为14 d)。一免、二免14 d后收集血清,通过ELISA和Western blotting检测抗体水平和特异性。二免后进行免疫保护试验,并对攻毒后小鼠的肝、脾、肺、肾进行细菌载量检测和病理组织学观察。【结果】SDS-PAGE检测到大小约为93 kD的蛋白表达,与SclE的理论分子量大小一致;Western blotting检测显示,表达所得重组蛋白能与SEZ阳性对照组(腹腔注射0.5 mL SEZ灭活疫苗)小鼠血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。ELISA检测显示,二免后小鼠血清中特异性抗体水平与一免后相比均有显著提升(P<0.05,下同),且可诱导小鼠产生高滴度的IgG,其中IgG1抗体水平(0.436±0.031)显著高于IgG2a(0.161±0.009),表明rSclE诱导的抗体亚型以IgG1为主;rSclE免疫小鼠可显著抑制SEZ在各脏器中的增殖能力,肝脏、脾脏出血及炎性细胞浸润的症状得到改善,肺脏和肾脏出血等病理损伤减轻;在小鼠免疫攻毒保护试验中保护70%小鼠免受致死剂量SEZ毒株的攻击。【结论】成功表达获得的rSclE能诱导小鼠产生SclE特异性抗体,且具有较好的保护效果,可作为一种SEZ潜在的疫苗候选抗原。 展开更多
关键词 马链球菌兽疫亚种(SEZ) SCLE 亚单位疫苗 免疫
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